黄芪甲甙对衰老HELF细胞端粒酶活性及klotho表达的影响.doc

黄芪甲甙对衰老HELF细胞端粒酶活性及klotho表达的影响 作者：郭蕾 魏晓东 欧芹 王昭 朱贵明 【摘要】 　　目的 探讨黄芪甲甙对衰老人胚肺成纤维细胞(HELF)端粒酶活性及抗衰老基因klotho mRNA表达的影响。方法 体外培养 HELF，实验组从50代开始加入黄芪甲甙，倒置显微镜观察细胞形态，MTT方法检查细胞活力，Dimiri氏法检测β半乳糖苷酶活性，TRAPPCR银染法检测端粒酶活性，RTPCR法检测klotho mRNA表达。结果 与青年组比较：衰老组细胞活力和klotho mRNA表达均降低(Plt;0.01)、β半乳糖苷酶活性升高(Plt;0.01)；与衰老组相比：黄芪甲甙可降低β半乳糖苷酶活性(Plt;0.01)、提高细胞活力、端粒酶活性和klotho mRNA表达(Plt;0.01)。结论 黄芪甲甙可以通过改变细胞端粒酶活性、klotho基因的表达而发挥其抗HELF细胞衰老的作用。 【关键词】 黄芪甲甙；端粒酶；klotho；衰老人胚肺成纤维细胞 　　黄芪抗衰老作用的研究以体内实验〔1〕和血清药理学〔2〕方法为常见,本实验以复制性衰老人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast，HELF)为研究对象，以黄芪的单体成分黄芪甲甙直接作用于衰老细胞，观察其对细胞衰老水平的影响及其作用机制，为黄芪甲甙抗衰老作用的确定及其分子药理学研究提供可靠的理论和实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验分组和处理 　　HELF细胞从23代开始，按常规一分二传代培养，＜35代为青年细胞，＞50代为衰老细胞，分四组：①青年组：(33±2)代为青年组；②黄芪甲甙组：黄芪甲甙溶于二甲基亚砜(DMSO)，用含0.1%黄芪甲甙的DMSO处理HELF；③对照组：培养液中加入同等剂量的DMSO作为对照，用含0.1%黄芪甲甙的DMSO处理HELF；④衰老组：(52±3)代为衰老组。 　　1.2 药物与试剂 　　TRAPRCR银染试剂盒、HELF细胞株(南京凯基生物公司)，黄芪甲甙购自上海融禾医药科技发展有限公司(批号：090224)，DMSO、焦碳酸二乙酯（DEPC）为Sigma公司产品， Trizol、RTPCR试剂盒购自大连宝生物有限公司，β半乳糖苷酶染色试剂盒购自碧云天。20 mg黄芪甲甙溶于2 ml DMSO中，制成10 mg/ml的储存液，-20℃保存，用时含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释1 000倍，使其终浓度为1 μg/ml，(DMSO终浓度为0.1%)。 　　1.3 指标测定 　　倒置光学显微镜下观察细胞形态，噻唑蓝（MTT）法测细胞活力，酶联免疫仪 490 nm测得光吸收值。Dimiri氏方法〔3〕检测β半乳糖苷酶活性，细胞核被蓝染定义为β半乳糖苷酶阳性染色，计算阳性率。TRAPPCR银染法检测端粒酶活性〔4〕，提取细胞端粒酶，并在94℃ 5 min；94℃ 30 s；50℃ 30 s；72℃ 90 s；30～36个循环72℃ 延伸10 min。 扩增；12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳， 17.5 v/cm预跑1 h，垂直电泳40～50 min。银染，经Tanon2500R数码凝胶图像分析系统照相分析。RTPCR法检测klotho基因mRNA表达，RNA提取及逆转录： Trizol提取细胞总RNA，参照TaKaRa RNA LA PCRTM Kit(AMV)Ver提供的条件进行逆转录，引物序列：上游5′TGGCACAGAGGTTACAGCATC3′；下游3′GACTAACCTAT CTTGGACGGA5′；扩增片段长度820 bp。选用βactin作内参，上游5′CTACAATGAGCTGCGCGTGGC3′；下游5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′，扩增片段长度273 bp，以klotho/βactin进行半定量分析。 94℃ 2 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35个循环，最后72℃延伸10 min进行PCR，扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶行水平电泳，电泳条件：80 V， 30 min，溴化乙锭显色，用Tanon2500R凝胶成像分析系统摄像，并进行面积灰度扫描。 　　1.4 统计学分析 　　数据采用x±s表示，统计经SPSS16.0软件处理，采用方差分析的LSDt检验进行组间比较。 　　2 结果 　　2.1 黄芪甲甙对衰老HELF细胞形态学改变的影响 　　见图1。青年细胞生长良好，呈长梭形或不规则形，无角质形成，细胞混杂生长。衰老细胞排列不规则，体积较大，形态扁平，胞浆区域增大，细胞质/细胞核的比例增加，胞浆中可见较多颗粒或空泡，青年细胞偶见。黄芪甲甙组与同代正常衰老组