志贺菌敏感株与诱导耐多药株蛋白质组学分析.docVIP

志贺菌敏感株与诱导耐多药株蛋白质组学分析 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：志贺菌敏感株与诱导耐多药株蛋白质组学分析 1 1 材料与方法 2 11 材料 2 12 方法 3 2 结果 4 第二向应用125%聚丙烯酰胺凝胶(银染) 5 3 讨论 5 文2：2327株结核分支杆菌耐多药情况分析 7 1 资料与方法 8 2 结果 9 3 讨论 9 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 志贺菌敏感株与诱导耐多药株蛋白质组学分析 文1：志贺菌敏感株与诱导耐多药株蛋白质组学分析 近年来，随着抗生素的广泛使用甚至滥用，造成志贺菌频繁发生变异，产生耐药株，且耐药率高、耐药产生速度快、耐药范围广，给细菌性痢疾的防治带来新的挑战，因此，深入探讨志贺菌的耐多药机制成为目前解决志贺菌耐多药的先决条件。本课题选用对抗生素敏感的1株志贺菌，以自身药物诱导方式构建出多重耐药菌株，通过比较敏感株与药物自身诱导耐多药株蛋白质双向电泳图谱，观察与志贺菌耐多药相关蛋白，并对部分表达差异蛋白进行基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MOLDI TOF-TOF)分析和数据库检索,旨在探索其耐多药机制。结果报告如下。 1 材料与方法 11 材料 111 菌株 (1)福氏痢疾杆菌标准株：菌株号51571-9（ 中国 药品生物制品检定所）； (2)敏感株：采用改良K-B纸片法，从临床分离鉴定的志贺菌株中，筛选1株对头孢噻吩(CF）、诺氟沙星（NOR）、庆大霉素（GM）、磺胺甲基异恶唑（SMZ）均敏感的福氏志贺菌作为敏感株。（3）诱导耐多药株：使用志贺菌标准株和分离出的敏感株， 参考 文献 〔1〕的次抑菌浓度(1/2 MIC)诱导耐多药方法，建立诱导耐多药株。 112 试剂与仪器 头孢噻吩等抗生素均为标准品(中国药品检验中心)。固相pH梯度干胶条（immobiline pH gradient pH3～10,L=24cm ）；IPG缓冲液、IPG覆盖液、两性电解质pharmalyte(pH3～10)、3-［(3-胆酰胺丙基)-乙二胺］-1-丙磺酸(3-［(3-cholamidopropyl)- dimethylammonio］-1-propanesulfonate,CHAPS)(美国Ameham Pharmacia公司)。丙烯酰胺、尿素（urea）、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、蛋白酶抑制剂丙甲基磺酰氟（PMSF）、亮抑蛋白酶肽（leupeptin）(美国Sigma公司)。固相pH梯度等电聚焦仪IPGphor IEF System ,垂直板电泳仪、ImageScanner光密度扫描仪、图像分析系统（美国Ameham Pharmacia公司） 12 方法 121 蛋白质双向电泳 （1）蛋白提取方法：采用超声兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解提取法〔2〕,略作改进。（2）可溶性总蛋白定量：应用bradFord法〔3〕对提取的可溶性总蛋白进行定量；（3）第一相固相pH梯度等电聚焦:按文献〔4〕,程序分别为30V7h，60V7h，150V05h，300V1h，600V1h，8000V12h。（4）平衡：按文献〔3〕。（5）第二相垂直板SDS电泳：按文献〔3〕。（6）染色：银染按Ameham Bioscience的银染方案稍作改进〔4〕。考马斯亮蓝染色按Neuhoff等的方法进行〔5〕。（7）图像扫描分析：用Ameham Bioscience的扫描仪投射扫描，分辨率为300dpi。数字化图像文件运用Image Master 2D Platinum软件分析。图像分析过程包括蛋白质斑点的检测、量化、背景扣除、匹配。蛋白质斑点经自动检测后进行手工校对，匹配之前先选一块胶作为参考凝胶，其他凝胶都与之匹配。 122 质谱分析 （1）质谱样品制备：比较双向电泳图谱，找到差异蛋白，切下1mm×1mm×1mm，置于15ml的Eppendorf管中,按文献〔6〕方法处理样品。(2)质谱鉴定:样品按照1∶1的比例,与含有α-氰基-羟基苯丙烯酸的50%乙腈/01%甲酸的溶液混合。所有质谱在4700 型MALDI TOF-TOF蛋白质分析系统下获得。选择反射式阳离子捕获方式，质量精确度为50mg/L;MS光谱质量范围800～4000Da。 123 数据库检索 光谱在全球蛋白服务工作站（Global Protein Server Workstation，GPS）进行处理和分析；搜索在NCBInr蛋白数据库进行；鉴定GPS可信区间应95％。搜索参数设置：相对分子质量误差范围±20%，肽片段相