重组PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术检测抗HCMV.docVIP

重组PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术检测抗HCMV 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：重组PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术检测抗HCMV 1 1材料和方法 2 文2：重组抗HER2ScFvFDTcaspase医学 6 1材料和方法 7 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 重组PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术检测抗HCMV 文1：重组PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术检测抗HCMV 0引言 胶体金免疫斑点法(colloidal gold immunodot assay,CGIDA)快速简便，吕贯廷等［1］成功地建立了CGIDA检测HCMVIgG的方法，但国内关于抗人巨细胞病毒(HCMV)IgM的临床检测的报道较少. 我们用基因工程方法合成HCMV pp150（841~1084aa）抗原,以胶体金为标记手段,建立了检测血清抗pp150 IgM抗体的胶体金免疫斑点法. 1材料和方法 材料 HCMV AD169毒种、宿主菌 DH5α, 原核表达质粒pMAlp2为山东省分子病毒学重点实验室提供. EcoR I, HindⅢ, T4 DNA Ligase, Wizard PCR Preps DNA Purification System, Wizard Plus Minipreps DNA Prurification Systems, IPTG, 硝酸纤维素膜（孔径 μm）等均购自Promega公司. 麦芽糖结合蛋白(MBP)纯化树脂购自BioRad公司. 抗人IgM及HCMVIgM ELISA试剂盒由山东省分子病毒学重点实验室提供. HCMV IgM阳性血清120份经青岛大学医学院附属 医院 妇产科研究室提供（晶美生物工程有限公司人巨细胞病毒IgM ELISA试剂盒检测）; 266份临床血清采自青岛大学医学院附属医院正常孕妇. 正向引物： 5′TGGCG↓AATTCACCTCTTCCGCTTCTTCGGC3′，反向引物：5′GTGTTA↓AGCTTCTATTCCTCCGTGTTCTT3′，PCR产物长度为651 bp,产物上游酶切位点为EcoR1，下游酶切位点为HindⅢ. 方法 重组pp150抗原的制备HCMV AD169株接种人胚肺二倍体细胞，待细胞出现病变()后，收集细胞，提取总DNA作为模板，通过PCR扩增出HCMV pp150多个强抗原决定簇区目的基因. 分别用限制性内切酶EcoR I, HindⅢ酶切上述扩增片段和质粒pMALp2，回收酶切产物和载体片段，然后进行连接反应. 将连接产物转化感受态宿主菌 DH5α，挑取经鉴定的单个菌落，37℃培养至A600 nm约为. 加ITPG分别诱导1, 2, 3, 4, 5 h后收集菌体，在50 mmol／L TrisHCl（pH ）溶液中超声波裂解（12 s/次，共3次），将沉淀溶于包涵体溶解缓冲液中(8 mol／L尿素，100 mmol／L NaCl，1 mmol／L EDTA， mmol／L PMSF，50 mmol／L TrisHCl，pH 8．0)，4℃, 6000 g离心10 min，回收上清. 每隔1 h用复性液(10 mmol／L GSH， 2 mmol/L GSSG，50 mmol／L TrisHCl，pH 8．0),将尿素浓度逐步降低到 mmol／L，4℃复性过夜，在透析液(50 mmol／L TrisHCl，pH )中4℃充分搅拌去除剩余尿素. 4℃, 6000 g离心10 min，取上清，复性蛋白1．5 mL (0．5 g／L)上样，用麦芽糖结合蛋白（MBP）纯化树脂纯化（具体操作见说明书）. 应用150 g/L SDSPAGE检测表达及纯化情况. 试剂盒的置备及检测方法在300 mL双蒸水中加入10 g/L枸橼酸钠 mL，煮沸后迅速加入 g/L氯金酸 mL ，继续煮沸10～15 min，冷却后用 mol/L碳酸钾调pH值至；取已纯化抗体作线性稀释，每管加入制备好的胶体金溶液1 mL，静置2 h,以保持红色不变的最小量管为胶体金与待标记蛋白的最适比例；取已纯化的抗原多肽与水溶性碳化二亚胺活化过夜，用PBS透析1 d；以3 mL胶体金溶液为基准，加入抗人IgM迅速混匀，15 min后加入10 g/L稳定剂 mL，混匀，以1000 g 10℃离心40 min，弃上清夜，沉淀重悬于等体积10 g/L稳定剂(pH ～)中，1000 g 10℃离心30 min，弃上清液，沉淀用1/5体积恢复液恢复. 用孔径为 μm的硝酸纤维素膜制成1 cm直径的方片， PP150蛋白、HCMVIgM（阳性对照）、PBS（阴性对照）3×3的点阵滴定