生物学做westernblot仪器.pptxVIP

生物学做Westernblot仪器会计学第1页/共50页Western Blot 常见检测方法化学显色法 如DAB显色 放射自显影法 如同位素化学发光法 如 ECL 化学荧光法 如IRdye680、IRdye780……第2页/共50页不同检测方法特点化学显色法操作简便，无需暗房和显影设备，显色直观，但灵敏度较低，国外已不常见。化学发光法（ECL）比化学显色法灵敏度高，可达pg水平。但由于是酶促反应，不同曝光时间得到的信号与样品量不成线性关系 ，不能做准确定量。荧光法采用荧光检测原理，操作简单，荧光信号强弱直接反映目的蛋白量，可进行精确定量；还可以根据荧光染料的不同，用不同的荧光二抗可以在同一张膜上同时检测两种蛋白质。ECL常见问题第3页/共50页暗房操作麻烦，曝光时间难以控制，无法准确定量背景高，高浓度蛋白易出现“吹泡”现象检测两种蛋白时，需要Stripping和Re-probe，操作复杂胶片上无法直接观察到Marker第4页/共50页解决方案：Odyssey 双色红外荧光成像系统 荧光 红外 双色荧光——准确定量、线性范围宽广红外——背景低、信噪比高双色——同时检测、同时输出第5页/共50页Odyssey VS ECL流程ECLOdyssey1跑胶跑胶2转膜转膜3封闭封闭4结合一抗、洗涤结合一抗、洗涤5结合酶标记二抗、洗涤结合红外染料标记二抗、洗涤，成像6发光试剂盒7暗房曝光成像Antigen on membranePrimary antibody binds to antigenON-SCREEN DisplayIRDye labeled secondary antibody binds to primary antibody 第6页/共50页荧光直接检测●信号持久●不需要底物●不需要底片/暗室INFRAREDLASER DIODEINFRARED APD DETECTORBackgroundSaturation荧光－准确定量 第7页/共50页CHEMILUMINESCENCE 动态信号－信号随时间变化 信号不与目标蛋白浓度成比例关系ODYSSEY 静态信号－信号不随时间变化 信号和目标蛋白浓度成比例关系INTENSITY0,00,0TIMETIMELow concentration / signalMedium concentration / signalHigh concentration / signal第8页/共50页红外荧光 VS 化学发光定量线性范围ECLODYSSEYOdyssey能检测到0.6pg的蛋白（灵敏度高）Odyssey成像呈现一个很好的线性（定量准确）Odyssey系统定量的线性相关性第9页/共50页1.5 ng0.8 pg 倍比稀释的 IRDye 800-标记的抗体. R2 从1.5 ng to 0.8 pg 是 0.99996, 极佳的线性相关性。极佳的线性相关性增加了定量的准确性第10页/共50页红外荧光 VS 化学发光Dilutions of transferrin detected with rabbit anti-Tf primary and Alexa Fluor 680 goat anti-rabbit secondary. Sensitivity is 250-fold higher than reported for the Bio-Rad Molecular Imager FX with fluorescent antibodies, 100-fold higher than ECL (BioTechniques 29:636-642).第11页/共50页红外荧光 VS 化学发光成像效果　Odyssey曝光３０秒曝光１分钟曝光５分钟曝光１０分钟第12页/共50页红外+荧光 DEMO实验目的检测培养细胞转染外源基因的表达状况实验步骤Odyssey:膜+一抗孵育+荧光标记抗体孵育+Odyssey扫描成像ECL:膜+一抗孵育+酶联二抗孵育+底物显色+ UVP扫描成像第13页/共50页Odyssey结果 ECL结果 Marker S1 S2 S3 S4Marker S1 S2 S3 S4信号强度302 62 30 19信号强度51 20 10 4（Odyssey软件分析结果） 10:4:2:1 稀释 结论Odyssey和ECL的相对灵敏度相差不大Odyssey红外激光成像系统具有更好的线性关系和更精确的定量结果 Odyssey扫描图能同时看到Marker 和目标蛋白，ECL看不到 MarkerVisible FluorophoresPAHsPorphyrinsBio