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氨基酸与 蛋白质一级结构;目 录;第四节 蛋白质的分离纯化、鉴定 分离纯化的基本步骤和原则 1．取 材：选取含有目标蛋白质丰富的材料 2．细胞破碎：条件尽可能温和,如匀浆法、研磨 法、超声波、溶菌酶、渗透压休克法 3．分离纯化 根据待分离Pr的特异理化性质,设计 分离纯化方法 4．鉴定分析 目标Pr纯度、含量、相对分子量 ;原理： 根据蛋白质在中性盐中的溶解度不同来分离 盐析与等电点沉淀 ;盐析: 在蛋白质溶液中加入中性盐,使Pr溶解度降低，Pr???子相互聚集并沉淀析出的现象称盐析。 作用原理：破坏电荷,争夺水化层。常用的中 性盐为 (NH4)SO4 、NH4Cl等 优点：不引起蛋白质变性,不同蛋白质盐析时 所需的盐浓度不同,可采用分段盐析。; 等电点沉淀: 利用蛋白质在等电点时溶解度最低,而各种蛋白质又具有不同等电点的特性进行分离的方法。 实际工作中常与盐析法、有机溶剂沉淀法联合使用 ;二. 离子交换柱层析 离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。 常用的阳离子交换剂有羧甲基纤维素,Poly树脂羧酸型，Poly树脂磺酸型；阴离子交换剂有二乙氨基乙基纤维 素，Poly树脂氨基型， Poly树脂季铵型。 ;蛋白质与离子交换树脂的结合是靠相反电荷的静电吸引,吸引力的大小与蛋白质的带电量及溶液pH及离子强度有关。洗脱顺序是带相反电荷少,极性大的先出。 P+A－+B－→P+B－+A－ 阴离子交换 阳离子交换树脂: PS-CH2COO－Na＋ 阴离子交换树脂: PS-CH2CH2N(C2H5)3 OH－ ;Ion-exchange chromatography;利用柱填料的疏水基团与蛋白质表面AA侧链的非极性链相互作用的不同来分离蛋白质。 市场上用的较多的有硅胶C18色谱柱、PS-DVB色谱柱等 ;四种蛋白质的色谱分离;四．凝胶过滤层析 －根据分子大小、形状不同的分离 凝胶过滤又称分子排阻或分子筛层析 原理： 比凝胶孔径大的分子不能进入球内网状结构 中的分子部分 小的分子完全 所走路线不同得以分离,洗脱顺序大→中→小 ;大孔的MKF填料;Size-exclusion chromatography;凝胶过滤层析常用来测未知样品的分子量;透析和超滤 ;五．亲和层析 —根据Pr与配体的特异结合建立的分离方法 原理：不同蛋白质对特定配体(Ligand)的特 异而非共价结合的能力不同。 1）特异配体共价接到载体(如琼脂糖、高聚物 微球)上 2）目标蛋白质通过带有配体的载体,产生特异 吸附。非目标蛋白或杂质直接流出 3）改变条件将微球配体结合的蛋白洗脱下来;亲和层析;由于不同蛋白质分子质量和形状不同，其pI不同，在一定的pH环境下,各自所带电荷的性质、数目不同,在电场中不同蛋白移动的方向和速度 就不同，这种现象 称为蛋白质电泳。;聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） ;七．液相层析（LC） 最近几年发展起来的一种新技术,不仅在分析方面可以给出满意的结果,而且在制备方面的高效、快速较之许多其他手段更表现出优异性能。而支撑色谱技术的核心是分离填料。 分离填料的不同, 分离的机理亦不同, 包括： 疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、手性分离及亲和层析;28肽的色谱鉴定;人红细胞生成素生产过程的质量检测;目 录; ;蛋白质的一级结构;1．定义： 蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序(sequence),一级结构的主要连接键是肽键。;2.蛋白质一级结构的书写;二. 蛋白质一级结构的测定;将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序;★片断重叠法的大体步骤： 1）测定蛋白质分子中多肽链的数目:鉴定多 肽链的N-末端,C-末端,根据N-末端或C-末 端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量 确定多肽链数目 2）拆分蛋白质分子的多肽链,用变性剂8mol/L 尿素、6mol/L盐酸胍断开多肽链的二硫桥, 对肽链进行拆分、分离;★片断重叠法的大体步骤： 3）肽链完全水解－AA组成及各种AA摩尔数 4）裂解多肽链成较小的片断,分离并测定多肽 片断的氨基酸顺序 5）比较两套以上片断的AA顺序,拼凑出整个肽 链的AA顺序 6）确定二硫键的位置 ;1）二硝基氟苯法(DNFB、FDNB法)– 灵敏度低 2）丹璜酰氯(DNS)法－－原理：DNS与N－末 端AA反应生成黄色DNS-AA衍生物。丹璜酰 基