单克隆抗体检测O.docx

PAGE PAGE 1 单克隆抗体检测O 一些单克隆抗体把O-G1cNA。作为特异的抗原识别位点，如RL2、HGAC85和MY95。然而，许多这类抗体同时具有肤特异性，只能识别一部分O-G1cNA。修饰的蛋白。Comer及其同事制备了一种针对RNA聚合酶II大亚基糖基化的C末端结构域的抗体CTD110. 6—一种广谱O-GlcNAc抗体。应当注重的是CTD110. 6并不能识别全部的O-Glc-NAc修饰。为了确定这种抗体的特异作用方式，在本试验中我们设置多个对比，包括：己糖胺处理纯化蛋白，以去除O-Glc-NAc；用法PUGNA c（对比试验2）处理细胞提取物，以提高O-Glc-NAc水平；用法游离GlcNAc竞争信号通路；在胶上加阳性、阴性对比，如：卵清蛋白（阴性，Sigma-Aldrich）和BSA-GlcNAc（阳性，Sigma-Aldrich)。 (1）材料1) Tris·HCl缓冲液（TBS) : 10mmo1/L Tris·HC1, pH 7.5;150mmo1/L NaCl。2) TBS-High Tween（TBS-HT)：10mmol/L Tris·HCl, pH 7. 5；150mmo1/L NaCl; 0. 3%（V/V) Tween 20。3) CTD 110. 6 ( Covance, Richmond, CA)，TBS-HI，稀释（1：2500)。4）辣根过氧化物酶标志（HRP）抗鼠lgm ( Sigma-Aldrich, StLouis, MO)，TBS-HT稀释（1 :5000)。5）增加型化学发光液（ECL) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)。6) 10 mmol/L GlcNAc，TBS-HT稀释。(2）办法1) 目的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分别，转印至PVDF膜或硝酸纤维素膜。2) TBS-HT室温封闭60分钟。3) CTD 110. 6 (1 : 2500, TBS-HT稀释，分离配成加与不加10mmol/L G1cNAc的溶液）、4℃过夜。4) TBS-HT洗膜3×10min。5）抗鼠二抗（Sigma, 1 : 5000, TBS-HT稀释）、室温封闭50min。6) TBS-HT洗膜5×10min。7）TBS洗膜1×10min。8）发光。