基因工程原理与技术-8复习过程.ppt

;二、用于构建基因组文库的载体 ;3、基因组DNA片段与载体的连接(重组DNA分子的构建) 连接效率主要受插入片段与载体的摩尔数比以及DNA片段总浓度的影响。因此，应通过连接预试验确定连接反应中载体臂和插入片段的用量。 ;4、重组DNA分子导入受体细胞 对于λ噬菌体载体、黏粒载体，重组DNA分子在体外包装成噬菌体颗粒，以噬菌体感染的方式将重组的DNA分子导入到大肠杆菌中。效率高，达1.8×108pfu/μg DNA。 对于YAC载体，采用电激法导入重组DNA分子。 5、转化体的筛选培养及基因组文库的获得 6、基因组文库的扩增、分装及保存 基因组文库扩增的方法：液体培养增殖法、影印滤膜培养法。 基因组文库扩增的问题：由于克隆的不均衡生长，从而导致相应克隆的丢失，导致基因组文库的代表性变差。 小包装保存，4℃保存半年、-80℃保存几年而滴度保持稳定。 ;第二节 cDNA 文库的构建 cDNA文库是指某生物、组织或细胞所有cDNA的的克隆群体。包括组织特异性cDNA文库、区域特异性cDNA文库。 一、用于构建cDNA文库的载体及载体片段制备 质粒载体、λ噬菌体载体，能满足0.5~10kb cDNA克隆。 二、 mRNA的提取及其完整性的确定 1、mRNA的来源(取材) 目标mRNA为高丰度的材料 2、mRNA的提取 olig(dT)n-纤维素柱层析法 olig(dT)n-磁珠分离法;3、mRNA完整性的确定 无细胞翻译系统检测法(麦胚抽提物、免网状细胞裂解物) 蛙卵检测法 凝胶电泳检测法(根据28s rRNA与18s rRNA的条带亮度判定) 4、mRNA的富集 特别是低丰度mRNA。 琼脂糖凝胶电泳法：回收率较低 变性蔗糖密度梯度离心法：回收率高 现在，一般是进行cDNA富集。;三、cDNA克隆片段的制备 1、cDNA第一链的合成 ;2、cDNA第二链的合成 ①自身引导合成法 ;②置换合成法 ;③PCR合成法 ;3、双链cDNA的末端处理及甲基化修饰 ①加同聚物尾 ;②接上人工接头 首先补平cDNA末端及甲基化修饰，然后再接上人工接头。;衔接头(adaptor);四、cDNA克隆片段与载体片段的连接及检测 1、平头末端连接法，无法回收插入片段 2、同聚物接尾法，接dA/dT，通过局部变性???S1处理来回收 3、人工接头法 五、重组cDNA分子导入受体细胞 如构建质粒文库，要有高质量的大肠杆菌感受态细胞(109pfu/μg DNA) 六、转化体筛选培养及cDNA文库生成 七、cDNA文库的扩增、分装及保存 值得注意的是：在构建cDNA文库时，如果用人工接头法，在酶切之前要用甲基化酶保护cDNA中的相应酶切位点。 一般情况下无需构建原核细菌的cDNA文库。 ;第三节 目的基因的获得 获得目的基因的主要途径：;一、从文库中分离已知序列的基因 1、核酸杂交法(菌落/噬菌斑原位杂交);2、PCR筛选法 特点：快速、简便。 程序：文库 → 多孔培养板 → 一列或一行培养物于一PCR管中扩增 → 凝胶电泳检测 → 阳性列或行分装培养 → 第二轮PCR → → → →阳性克隆 3、免疫学筛选 特点：筛选表达文库 程序：与核酸杂交筛选相似。见右图 ;二、从文库中分离未知序列的基因 1、染色体步移法(图位克隆法);三、基因的人工合成 化学合成法与酶促合成法相结合 ;