基因工程实验_biochemlab说课讲解.ppt

;实验目录;⑴ 目的基因的获取 　　　基因组总ＤＮＡ提取　　凝胶电泳检测　　 ＰＣＲ扩增目的基因　　 ＰＣＲ产物的电泳检测　　 ＰＣＲ产物纯化　　　获得目的基因ＭＨＣ;⑵ＤＮＡ重组、转化 　　　ＭＨＣ与pMD18-T连接　　DH5a感受态细胞制备　 　 转化、平板涂布、培养 ⑶筛选与鉴定 　　　抗生素抗性筛选　　挑单菌落培养　　提取质粒　　质粒酶切、电泳检测　　;2.微量移液器的使用;⑵使用注意事项;3. 琼脂糖凝胶制作;掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。; 生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。 ;消化缓冲液: TE ?、EDTA、 NaCl、 SDS、蛋白酶K Tris平衡酚、氯仿:异戊醇(24:1)，NaAc，无水乙醇，70%乙醇 ;１、切取组织 ，剪碎放入研钵(越细越好)，磨成粉末。以消化缓冲液处理55℃水浴过夜，获得组织消化液。 ２、取出消化组织液，5000rpm?，３min，取上清液于新离心管 。 ３、 加等体积Ｔris-平衡酚，轻轻混匀５min。 4、1000rpm，10min，留上清，取上清液于新离心管 。 ５、加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，轻轻混匀５min。 ６、同４。 ７、加等体积氯仿:异戊醇，轻轻混匀５min。 ８、同４。;９、加?1/10?体积3mol/L?NaAc，及２.５?倍体积预冷（－２０℃）无水乙醇，混匀。 －２０℃ 沉淀３０min。 １０、12000rpm，15min，弃上清。 １１、加70%乙醇1ml，混匀。 １２、 同１０。 １３、ＥＰ管放置于烘箱中烘干。 １４、加３０ul TE或ddH2O溶解ＤＮＡ。 １５、琼脂糖凝胶电泳检测。 ; 　　　提取染色体ＤＮＡ的基本原理是什么？操作中应该注意什么？;１、学习ＰＣＲ扩增的基本原理。 ２、掌握ＰＣＲ技术的常规操作。 ３、了解ＰＣＲ扩??的参数设计。;１、聚合酶链反应 (Polymerase chain reaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的ＤＮＡ为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异ＤＮＡ片段的过程。 ２、ＰＣＲ反应体系 　　引物、dNTP、 Mg２＋ 、模板、 Taq DNA聚合酶， Buffer。;３、ＰＣＲ循环参数 ① 9５℃ 5min ② 9５℃ 30s ③ 5２℃ 30s ④ 72℃ 30s ⑤ goto② ２９times ⑥ 72℃ 10min; Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液， MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液;１、在0.2ml PCR 微量离心管中配制30ul反应体系。 　　　 　dd water 　　　　　　　　20.5ul 10×PCR buffer（不含MgCl2） 　　　　　　　3ul 25mM MgCl2 　　　　　　　2ul 10mmol/L dNTP 　　　　 　　　　　1ul 10μmol/L Primer 1 　　　　　　　　1ul 10μmol/L primer 2 　　　　　　　　1ul 模板 　　　　　　　　　　　　　1ul 　Taq酶 　　　　　　　　　　　　　0.5ul 总体积 　　　　　　　　　　　30ul;２、在离心机中混匀。 ３、ＥＰ管放入ＰＣＲ仪中，按照原理中的条件设置程序，进行ＰＣＲ反应。 ４、PCR结束后，取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。 ;五、思考题;实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接;一、实验目的;二、实验原理;2. 利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。 3. Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3’端各多连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。;三、实验用