PCR异常扩增曲线分析.pdf

PCR 异常扩增曲线分析 PCR 异常扩增曲线分析 1. PCR 正常扩增曲线 1. PCR 正常扩增曲线 随着实验的进行，扩增产物不断累积，相应的荧光信号也不断在增加，每进行一 随着实验的进行，扩增产物不断累积，相应的荧光信号也不断在增加，每进行一 个循环就采集一次荧光的信号，经过一定的循环数后（比如 40 个循环），就可 个循环就采集一次荧光的信号，经过一定的循环数后（比如 40 个循环），就可 以得到下面的扩增曲线图 （横坐标代表扩增的循环数 cycle，纵坐标代表荧光的 以得到下面的扩增曲线图 （横坐标代表扩增的循环数 cycle，纵坐标代表荧光的 强度）。 强度）。 这其中还需要弄清楚一些基本概念，如： 这其中还需要弄清楚一些基本概念，如： 基线：指在 PCR 扩增反应的最初的几个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直 基线：指在 PCR 扩增反应的最初的几个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直 线，该直线叫做基线。这个了解即可，对实验操作没什么影响。 线，该直线叫做基线。这个了解即可，对实验操作没什么影响。 阈值线：一般来说，前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，阈值的设定就 阈值线：一般来说，前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，阈值的设定就 是 3-15 个循环荧光信号标准差的 10倍，在 PCR 扩增的指数期（如图中箭头所指）。 是 3-15 个循环荧光信号标准差的 10倍，在 PCR 扩增的指数期（如图中箭头所指）。 说的这么严肃，其实很多仪器 自动设定的阈值线基本能够满足我们的实验要求， 说的这么严肃，其实很多仪器 自动设定的阈值线基本能够满足我们的实验要求， 不需要我们手动设置的。 不需要我们手动设置的。 CT 值：我们常会用 CT 值来计算我们的相对含量，即扩增产物的荧光信号到达设 CT 值：我们常会用 CT 值来计算我们的相对含量，即扩增产物的荧光信号到达设 定的阈值线时所经历的扩增的循环数，也就是图中扩增曲线和阈值线的交汇处的 定的阈值线时所经历的扩增的循环数，也就是图中扩增曲线和阈值线的交汇处的 横坐标所显示的值。 横坐标所显示的值。 2. 标准曲线 2. 标准曲线 做标准曲线有啥用？标准曲线可以用来确定未知的样品的初始量。如果是需要绝 做标准曲线有啥用？标准曲线可以用来确定未知的样品的初始量。如果是需要绝 对定量，是必须要有标准曲线的。 对定量，是必须要有标准曲线的。 怎么做呢？每个模板的 CT 值与该模板的起始的拷贝数的对数是存在线性关系 怎么做呢？每个模板的 CT 值与该模板的起始的拷贝数的对数是存在线性关系 的，起始的拷贝数越大，CT 值就越小。标准品按照一定的倍数稀释 5-6 个浓度 的，起始的拷贝数越大，CT 值就越小。标准品按照一定的倍数稀释 5-6 个浓度 左右，根据 RT-PCR 的反应条件进行反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标， 左右，根据 RT-PCR 的反应条件进行反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标， CT 值为纵坐标，绘制线性曲线。而未知样品的拷贝数即可根据曲线方程计算得 CT 值为纵坐标，绘制线性曲线。而未知样品的拷贝数即可根据曲线方程计算得 来。 来。 那么，问题来了，这个标准曲线的标准品怎么确定呢？ 那么，问题来了，这个标准曲线的标准品怎么确定呢？ （1）如果是做绝对定量，标准品的要求比较高，这个的制备过程也相对复杂一 （1）如果是做绝对定量，标准品的要求比较高，这个的制备过程也相对复杂一 些，但结果也更加精确。 些，但结果也更加精确。 要求： 要求： 必须是准确定量的、标准化的、稳定的质粒 DNA （也可以是基因组DNA，纯化后 必须是准确定量的、标准化的、稳定的质粒 DNA （也可以是基因组DNA，纯化后 的PCR 产物等）， 的PCR 产物等）， 5-6 个稀释梯度； 5-6 个稀释梯度； PCR 反应仪器要同一种，并且同时操作； PCR 反应仪器要同一种，并且同时操作； 反应的条件一致：反应体系、参数等等； 反应的条件一致：反应体系、参数等等； 反正能一致的都一致就对了。