基因克隆的酶学基础.pptVIP

DNA聚合酶 I 聚合活性 第六十页，共106页 DNA聚合酶 I 的5’-3’核酸外切酶活性 第六十一页，共106页 2．E.coli DNA 聚合酶 Ⅰ 的用途 切口平移法（nick translation ）标记 DNA 所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反应 5’ 3’ Mg2+,DNaseI dNTP,DNA polyI 切口平移 第六十二页，共106页 探针标记 双链DNA分子 由DNaseI产生的单链缺口,带有3’OH末端 大肠杆菌DNA聚合酶I 的5’ 3’外切酶活性从缺口5’-P一侧移去一到数个核苷酸 大肠杆菌DNA聚合酶I将32P标记的核苷酸掺入取代原先被删除的核苷酸 重复进行?和(d),使缺口沿着5’ 3’方向移动. 第六十三页，共106页 （二）、Klenow DNA 聚合酶 E.coli DNA polymerase Ⅰ large fragment （Klenow fragment） ??大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去 5‘--3’ 外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和 3‘--5’ 外切活性不受影响，分子量为 76kDa 。 第六十四页，共106页 活性：与 E.coli DNA 聚合酶 Ⅰ 的活性是一致的。但没有 5‘--3’ 外切活性 作用： ① 补平 3 凹端 DN