基因克隆的酶学基础 (3).pptVIP

1. DNA连接酶 催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键 需要：3’-OH、5’-P以及NAD+或ATP做能源 不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA必须是双螺旋DNA分子的一部分 nick gap 第二十六页，共61页 DNA连接的分子机理 第二十七页，共61页 连接反应的影响因素 1. 连接缓冲液的影响：合适酸碱度，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。 2. ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，过浓会抑制反应。由于ATP极易分解，含有ATP的缓冲液应于-20℃保存，溶化取用后立即放回。最好小管分装贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。 第二十八页，共61页 4、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时间为