基本常用技术.ppt

细胞冻存时，存在两种损伤：冰晶损伤 　　　　　　　　　　　　　溶质损伤 　 冰晶损伤：由于温度下降，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内、外结冰而致的细胞损伤被称为细胞的冰晶损伤。 冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。　　　 第三十页，共46页 溶质损伤：因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤。 细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便发生渗漏。 溶质损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。 第三十一页，共46页 如果在溶液中加入冷冻保护剂时，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。 保护机理： 冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成 ； 通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。 第三十二页，共46页 影响冷冻效果的因素有以下几点： 　1.冷冻速率 　当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。 　当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。 2.冷冻保存温度： 液氮温度(-196℃)是目前最佳冷冻保存温度。 应用-70℃～-80℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。 第三十三页，共46页 基本常用技术 第一页，共46页 第一节 无菌技术 防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。 细胞培养工具做到细胞培养专用 进出细胞培养室做到更衣换鞋 超净工作台紫外照射时不要放置过多物品遮挡紫外线 第二页，共46页 一、操作区消毒 1.使用紫外线灯灭菌，照射细胞培养室和超净工作台20-30min。 2.在用紫外线灯照射期间，超净工作台上放置物品不要过多，留有死角阻碍照射，勿置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张覆盖)。 3.所有操作用具（包括培养瓶）要经75%的乙醇擦拭后才可放置进超净工作台内。 4.实验开始前使用75%的乙醇擦拭超净工作台台面。 第三页，共46页 二、洗手和着装 1.进入细胞培养室更换专用室内鞋和无菌服、帽子和手套。 2. 使用75%酒精或0.2%的新洁尔灭洗手。 3.实验过程中可能触及污染物品或者出入培养室均要洗手。 第四页，共46页 三、火焰消毒 1.在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作,需要在酒精灯附近进行。 2.实验中使用器械均要经过火焰烧灼进行。 3.金属器械不宜灼烧长，防止退火和过热。 4.含营养液的吸管不要灼烧防止营养液碳化。 5.培养瓶口过火时间不要太长防止烧死细胞。 第五页，共46页 四、培养操作 1.操作台面布局合理 2.不用手触及已消毒物品 3.操作保持一定顺序，动作准确敏捷 4.组织或细胞在未做处理前或培养液在未用前，勿过早暴露在空气中；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。 5.防止各种用液的交叉污染。 6.不向操作方向讲话或咳嗽 第六页，共46页 原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 意义: 1.原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。 2.利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。 3.原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。 第二节 原代培养 第七页，共46页 取材原则： 1.幼体组织尤其是胚胎组织比年老个体的组织容易培养； 2.分化程度低的组织比分化程度高的容易生长； 3.肿瘤组织比正常组织容易培养。 4.取材之后，最好立即培养，如因故不能培养时，应把组织切成1 立方厘米左右的小块，置于培养液中，4℃贮存，存放时间不宜超过24 小时。 5.从体内取材时，应严格保持无菌，避免受到紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物如碘、汞等。取肿瘤和其它病理组织时容易带菌，为减少污染，可用含500-1000 单位／毫升的青、链霉素BSS 液，漂洗5-10 分钟后再做培养处理。 第八页，共46页 取鼠胚组织 引颈法处死小鼠 整个小鼠浸入75％酒精中2 ~ 3 秒钟 打开胸腔 取出组织 第九页，共46页 组