园艺学实验技术思考题及答案.docVIP

1、请阐明 PCR 的原理和引物设计的注意事项 原理： PCR技术的基本原理 类似于 DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互 补的寡核苷酸引物。 PCR由变性 -- 退火 -- 延伸三个基本反应步骤构成：①模板 DNA的变性：模板 DNA经加热至 93℃左右一定时间后，使模板 DNA双链或经 PCR扩增形成的双链 DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板 DNA与引物的退火 ( 复 性) ：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至 55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸： DNA模板 -- 引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补 的半保留复制链重复循环变性 -- 退火 -- 延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链” ，而 且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～ 4 分钟， 2 ～ 3 小时就能将待 扩目的基因扩增放大几百万倍 注意事项： ①引物长度： 15-30bp ，常用 20bp 左右；②引物扩增跨度：以 200-500bp 为宜， 特定条件下可扩增至 10kb 的片段；③引物碱基： G+C含量为 40-60%为宜， ATGC最好随机分 布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸成串排列； ④避免引物内部出现二级结构， 避免两条 引物间互补， 特别是 3’端互补； ⑤引物 3 端的碱基， 特别是最末及倒数第二个碱基应严格 要求配对； ⑥引物中最好有合适的酶切位点； ⑦引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显 同源性；⑧序列 Tm为 55-60 ℃，尽可能与上下游引物的 Tm值一致，不超过 2℃ 2、试述 Southern 技术的原理，操作和注意事项 原理： 将待检测的 DNA分子用 / 不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离， 继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上， 固定后再与同位素 或其它标记物标记的 DNA或 RNA探针进行反应。 如果待检物中含有与探针互补的序列， 则二 者通过碱基互补的原理进行结合， 游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测， 从 而显示出待检的片段及其相对大小。 操作： ①基因组酶切； ②用琼脂糖凝胶电泳队 DNA片段按分子量大小分离； ③将 DNA片段在 琼脂糖凝胶电泳变性成单链后，再转移到适当的故乡支持物上并与之结合（即转膜） ；④探 针与膜上 DNA杂交；⑤检测 注意事项： ①将凝胶中和至中性时，要测定 pH，防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜；②要注 意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维膜之间的气泡 3、试述 Northern 技术的原理操作和注意事项 原理：在变性条件下将待检的 RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳， 继而将其变性并按其在凝胶中 的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的 DNA 或 RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行 结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测， 从而显示出待检的片段及其相 对大小。 操作： ① RNA的提取；② RNA变性电泳；③ RNA转移和固定（即转膜） ；④探针与膜上的 RNA 杂交；⑤检测 注意事项： ①用于 RNA电泳、转膜的所有器材均须预处理以除去 RNAse，以免样品的降解； ②转膜时，注意赶走气泡 4、试述质粒提取的原理和注意事项 原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒 DNA与线状的染色体 DNA片段在拓扑学 上的差异来分离它们。 在 pH 值介于 12.0-12.5 这个狭窄的范围内，线状的 DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下， 共价闭环质粒 DNA的氢键虽然断裂， 但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结 合在一起。当加入 pH4.8 的醋酸钾高盐缓冲液使 pH 降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两 条互补链迅速而准确地复性， 而线状的染色体 DNA的两条互补链彼此已完全分开， 不能迅速 而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。 通过离心， 线状的染色体 DNA与不稳定的大分子 RNA、蛋白质 -SDS复合物等一起沉淀下 来，而闭合环状质粒 DNA却留在上清液中。 注意事项：（碱裂解法） ①加入溶液 2 后不要剧烈振荡，只需轻轻颠倒几次离心管；②加入 溶液 2 后，复性时间不宜过长，一般是 5 分钟，否则会使染色体复性；③在用苯酚、氯仿抽 提时应用 TE 缓冲液将原溶液的体积扩大，一般是 200～ 300 微升，以减少 DNA的损失；④ 在加入酚氯仿的步骤