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实验二 淀粉酶米氏常数的测定 一、目的要求 了解底物浓度与酶反应速度之间的关系，学习和掌握米氏常数（ Km ）及最大反 应速度（ Vm ）的测定原理和方法，测出淀粉酶在以对淀粉为底物时的 Km 和 Vm 值。 二、原理 酶促反应 v-[S] 曲线 V [ S] m v 推导出米氏方程为： Km [S] 其中 [S] 为底物浓度； v 为初速度； Vm 为最大反应速度； Km 为米氏常数。 米氏常数 Km 是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。 特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时， 米氏常数 Km 往往可以反映出酶与 各种底物的亲和力的强弱。 测定 Km 和 Vm ，可通过作图法求得。 最常用的 Lineweaver-Burk 双倒数作 图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即： 1 K 1 1 m v Vm [ S] Vm 以 1/v 对 1/[S]作图，可得一条直线，所得直线的截距是 1/Vm ，斜率为 Km/ Vm 。 通过 Lineweaver-Burk 作图法作图后可方便的求出 Km 值。 三 实验材料、仪器和试剂 1．实验材料 淀粉酶购自国药集团医药有限公司。精确称取酶制剂 0.1g(以大约 2000 U ／g 计 )，先用少量 40℃蒸馏水溶解、浸提。将上层液小心倾入 500ml 容量瓶内，沉 淀再加水捣研。如此重复，最后全部移入容量瓶中，定容后摇匀，用四层纱布过 滤，滤液供测试定用。 2 ．仪器 比色管，试管 25 mm ×200 mm，平头移液管 (可用磨去尖头的 2mL 移液管制 )； 刻度吸管 5mI—(X1) ，移液管 20 mI ；秒表，吸耳球 ( ×1)，电热恒温水浴锅， 721 型分光光度计。 3．试剂 (1)原碘浓 称取碘 11 g，碘化钾 (KI)22 g ，先用少量蒸馏水使碘—碘化钾完 全溶解，定容至 500 mL，贮于棕色瓶内。 (2)稀碘液 取原碘液 2mL ，加碘化钾 20 g，用蒸馏水定容至 500 mL．贮于 棕色瓶内。 (3)4％可溶性淀粉 精确称取可溶性淀粉 4.000g （精确至 0.001g），用少量 蒸馏水调匀。 边搅拌边加入煮水 70mL ，加热煮沸至透明， 冷却后定容至 100 mL, 此溶液现配现用。 2 4 (4)0.02mL pH 6.0 磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢二钠 (Na HPO . 12H O)45．23g 和柠檬酸 (C H O 〃H O)8.07g，用蒸馏水溶解定容至 1000 mI 2 6 8 7 2 用酸度计或 pH 试纸校正 pH 。 （5 ）0.1moL/L HCl 取 36%盐酸（饱和浓盐酸） 0.43ml 加入已加有少量蒸馏水的 50ml 容量瓶 中,加水稀