一种简便高效利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的方法（临床医学资料）.docVIP

一种简便高效利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的方法（临床医学资料） 文档信息 属性： F-01NP3P，doc格式，正文13929字。质优实惠，欢迎下载！ 适用： 作为医学资料、临床医学资料写作的参考文献，解决如何写好实用应用文、正确编写文案格式、内容摘取等相关工作。 目录 TOC \o "1-9" \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：一种简便高效利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的方法 2 1 材料与方法 2 2 结果 4 3 讨论 4 文2：基因改造中快速PCR定点突变方法应用 5 1 材料 5 14 定点突变 6 2 结果 7 1：EcoRI酶切后的pESOD质粒;2：Marker 7 3 讨论 7 参考文摘引言： 8 原创性声明（模板） 9 文章致谢（模板） 10 正文 一种简便高效利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的方法（临床医学资料） 文1：一种简便高效利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的方法 Overlap-exteion PCR was used to mutagenate human TGF-β2 gene promoter (-270bp~+280bp）-114bp region from 5'CGTG3' to 5' TTTG3'. The fit two PCR products were electrophoresised on agarose-gel, itead of purification, theaimed segments gel were cut down and put into EP at -80℃ for 10-20min cool, then the gel were centrifuged and thesupernatants were used as template for the third PCR. The final PCR segment was cloned into pGL3-basic foequencing. Results: huaman TGF-β2 gene promoter mutant had been successfully cotructed. Conclusion: The methodwas effective and simple for site-directed mutagenesis cotruction. Key wordsOverlap-extention PCR; Mutagenesis; Gene sequencing 随着分子生物学研究的突飞猛进，基因定点突变技术成为一项重要的分子生物学实验技术手段，在基因表达及蛋白质的结构与功能之间关系等方面的研究中得到广泛的应用。常用的定点突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变及盒式突变。目前，PCR介导的定点突变技术是使用最普遍的定点突变方法，以PCR为基础的突变方法一般有大引物突变、重叠延伸突变及一步快速突变。重叠延伸突变PCR可以在DNA区段的任何位置突变，且可以在侧引物的两端设计酶切位点，方便进一步的连接克隆[1-2]。本研究对传统重叠延伸PCR法进行定点突变的实验方法进行了改进，进一步节约了实验成本，缩短了实验周期，是一种简便、经济、快速、准确的基因定点突变方法。 1 材料与方法 材料Pyrobest TaqDNA Polymerase、dNTP、T4 DNA连接酶、限制性内切酶MluⅠ和BglⅡ及琼脂糖购自大连宝生物工程有限公司，凝胶回收和质粒提取试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司，报告载体pGL3-Basic购自Promega公司。引物（引物1：5'GTATCAACGCGTAAAACGGGAGACTTGATTGT3',引物2：5' GATCTAAGATCTATTGCTCGCTTAGGGTAGG3'，引物3：5'ACCAAAAGCTCTCCCCGAAC3'，引物4：5' GGGAGAGCTTTTGGTCTAAGTA3' ）由上海生物工程有限责任公司合成，其他试剂均为进口分装。 方法 正常人TGF-β2基因-270bp~+280bp启动子区报告基因的构建 首先利用引物1、引物2从人血DNA中扩增人TGF-β2基因启动子区-270bp~+280bp的基因区段，然后将此PCR产物进行凝胶回收，回收片段与载体pGL3-Basic分别经MluⅠ和BglⅡ双酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，经克隆培养后挑取阳性菌落进行培养，提取质粒后送公司测序。 人TGF-β2基因启动子区突变体基因的构建 根据人TGF-β2基因启动子区-114位