IPP 分析免疫组化图片.ppt

3.用IPP分析免疫组化图片的过程 拍摄样品照片。 选取图片上具有染料色调的区域（AOI，area of interesting）。 测量该区域的IOD。 选择并测量有效统计区域的面积 计算光密度平均值IOD/area（ mean density ） 计算同一实验组切片各照片的平均及标准差。 用统计学方法分析各实验组的平均mean density之间是否有显著性差异。 第三十页，编辑于星期二：十七点 四十分。 3.1用于免疫组化半定量分析的照片拍摄 与普通显微镜照片不同，用于免疫组化分析的显微镜照片有其特殊的拍摄要求。 第三十一页，编辑于星期二：十七点 四十分。 显微镜光源 正确调整显微镜光源为日光色温的白色光。此时是加蓝色滤光片，灯丝电压为9V左右。一般的显微镜上都会有指示的。此时的镜下视野会感觉明亮得有点刺眼。 不能通过调整聚光镜光圈的方法减低亮度，这会影响到光学系统分辨率及图象的清晰度。 不能加过大的灰度镜减低亮度。用25%的ND滤光片还行。6%的ND滤光片常导致色彩失真。 如果照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片色彩，从而使得测量结果不准确。 第三十二页，编辑于星期二：十七点 四十分。 固定显微镜的工作条件 不仅是光源亮度，除了更换样品时调节载物台位置，其他部件一律固定下来。特别是不要来回切换使用不同放大倍数的物镜。使用一个物镜拍摄所有的照片后，再切换到另一个物镜上拍摄照片。 为保证显微镜光源的稳定一致，所有照片应该一次拍摄完成。不能分数次拍摄。若能给显微镜加上稳压电源就更好了。这能保证显微镜光源亮度的稳定。 第三十三页，编辑于星期二：十七点 四十分。 必须使用手动控制曝光的相机 对每张照片要使用相同曝光时间，而不是由相机自动控制曝光。 染色深的阳性样品就应该拍摄得较暗。染色浅的阴性对照样品则应该拍摄得较明亮。 各种拍摄条件确定后，就必须使用这个条件一次拍摄完所有的照片。以保证它们的曝光一致。 第三十四页，编辑于星期二：十七点 四十分。 控制相机曝光时间 要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方呈现纯亮的白色。 拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰度值应达到230左右。可以使用图象分析软件测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图像分析数值的偏差。同时背景灰度值也不宜过高。 把空白灰度值调到230以上相当于在分光光度计上调节100%透射。 第三十五页，编辑于星期二：十七点 四十分。 背景的影响 左图：暗且偏蓝的背景严重影响到了阳性区域的色调。而且降低了黄色象素点的IOD值。这会严重影响分析结果。有的CCD具有手动较正色温的功能，可以较正一下背景色调，但暗背景既使不偏色也是影响分析结果的。 第三十六页，编辑于星期二：十七点 四十分。 较暗的背景值对分析结果的影响 显著性差异 无显著性差异 第三十七页，编辑于星期二：十七点 四十分。 扣背景后依然没有显著性差异 注意误差线增大了，依然没有显著性差异 第三十八页，编辑于星期二：十七点 四十分。 不能使用相机的自动白平衡 自动白平衡功能是相机根据照片总体色彩情况自动对每张照片进行白平衡校正。这会严重影响分析测量的准确性。显微镜照片用一两种染料染色，照片的色彩就应该是不平衡的，不能校正。 第三十九页，编辑于星期二：十七点 四十分。 最好使用专业CCD拍摄 民用数码相机适用于拍摄日常生活中的照片，其自动曝光、自动白平衡功能会有效改善照片的直观效果。但对于显微镜照片，这些功能却会改变照片的原始面貌，而且它对每一张照片都使用了不同的拍摄条件。严重影响照片的分析测量结果。要想关闭这些功能，往往要进行很复杂的设置。 不能使用自动白平衡校正，但在拍摄前使用手动的白平衡校正背景色彩却是必须的。在拍摄照片时要对相机进行背景色彩校正，使得拍摄出的照片中空白的背景呈白色。这种较正将应用于所有拍摄的照片上，与自动白平衡较正不同。自动白平衡较正是对每一张照片都进行各自不同的色彩较正。 第四十页，编辑于星期二：十七点 四十分。 应当把照片存为无损压缩格式TIFF 特别是对于染色较浅的图片，保存为jpeg格式后会损失亮度细节，导致测量误差增大。 注意那些马赛克 第四十一页，编辑于星期二：十七点 四十分。 总结拍摄注意事项： 调整显微镜光源亮度（电压9伏），足够白，足够亮。 调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值最好能达到230以上。 确认相机未使用自动白平衡功能。但要使用手动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。 使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件（曝光及白平衡设置）一次拍摄完所有照片。 保存照片为TIFF格式。相素不必太大。 第四十二页，编辑于星期二：十七点 四十分。 3.2用Image-pro plus分析免疫组化图片 与photoshop不同