第四章电泳技术.ppt

5、剥胶、染色、脱色： 将凝胶板取下，方位标记→切去浓缩胶 →剥胶→放入培养皿中→加入染色液，染色0.5-1h。 染色完毕后，倒出染色液，并换脱色液2-3次，直至凝胶的蓝色背景褪尽，蛋白质区带清晰为止。 剥 胶 剥 胶 切 胶 将胶剥到染料中.用小刀沿着胶边切一小口,用滴管沾着染料顺着切开小口滴染料.胶片自动从玻板脱落. 第三章 电泳技术 第五节 等电聚焦（IEF） 基本原理： 蛋白质有一定的等电点，在一定pH梯度的载体，pH大于等电点时蛋白质带负电，反之带正电，相等时不带电。蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的一个连续稳定的线性pH梯度中电泳，向两极迁移直到与等电点的相对应pH位置上时停止，形成不同的区带而分离。 第三章 电泳技术 第五节 等电聚焦（IEF） 优点： 分辨率高 无扩散现象 可直接测定蛋白质的pＩ 分离快，能保持原有活性 缺点： 电泳时应使用无盐样品 有些样品溶解性差，易沉淀 蛋白质在pＩ附近易沉淀影响分离效果。 第四章 电泳技术 概述 基本原理 醋酸纤维薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 等点聚焦（IEF） 电泳后大分子的检测 第三章 电泳技术 定义: 电泳(electrophoresis)是电解质在直流电场的 作用下，正离子向负极、负离子向正极移动的现象 特点: 凡带电物质均可用此法进行定性、定量分析样品 样品用量极少， 设备简单， 可在常温下进行， 操作简便省时， 分辨率高。 概 论 第三章 电泳技术 分类： 纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 概 论 自由电泳: 不用支持物 区带电泳: 有支持物 按有无支持物： 按不同支持物： 第三章 电泳技术 第一节 基本原理 迁移速率 迁移速率是指带电颗粒在单位电场下泳动的速度。颗粒在电场下的迁移速率的差异是电泳技术的基础。 式中μ是迁移率，υ为颗粒迁移速度，E是电场强度或电势梯度（V/cm)，d是颗粒移动距离(cm），I是支持物的有效长度（cm）,U是支持物两端实际电压（V)，t是通电时间。 第三章 电泳技术 二. 迁移速率的主要影响因素 第一节 基本原理 带电粒子的性质：颗粒带静电荷多、直径小、近球形，泳动速度越快，反之越慢。 电场强度：带电粒子迁移速度与电场强度成正比。 溶液的pH：pH决定了带电粒子解离的程度, 离等电点远，带净电荷越多，电泳速度越快。 溶液的离子强度：离子强度越高，带电粒子泳动速度越慢，反之越快。 电渗作用：电渗是指在电场下，液体对固体支持物的相对移动速度。若样品泳动的方向与电渗方向一致，则加快样品的表观迁移速率。 第三章 电泳技术 优点： 电泳区带界限清晰 通电时间较短（20min~1h） 对各种蛋白质基本没吸收，无拖尾现象 不吸附染料 第二节 醋酸纤维薄膜电泳 概念: 醋酸纤维薄膜（CAM）是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。醋酸纤维薄膜电泳就是以醋酸纤维薄膜支持体的电泳技术。 缺点： 分辨率低、样品用样很少不易制备。 第三章 电泳技术 膜的性质 缓冲溶液的组成、PH值和浓度 电流和有效电压 电泳的时间和温度 电泳槽的密封性 第二节 醋酸纤维薄膜电泳 电泳影响因素 ： 缓冲液的选择： 浓度太低，则区带宽度增大；太高，则区带不易分离 样品含盐量高时，采用挥发性缓冲液 血清蛋白宜用pH8.6的巴比妥或硼酸缓冲液 氨基酸宜用pH7.2的磷酸缓冲液 第三章 电泳技术 第二节 醋酸纤维薄膜电泳 结果不满意或失败的原因分析 醋酸纤维薄膜：过分干燥；弯曲；表面缓冲液过多。 缓冲溶液：浓度过高；长时间多次使用浓度改变。 样品和加样：样品量太多；加样不整齐；起始 位置错误。 电泳条件：时间；电泳槽密闭性；电流；温度。 染色和透明：染色液多次使用，PH值改变；未干 燥就 进行透明处理。 操作步骤: 点样 电泳 染色 漂洗 透明 测定光密度 第三章 电泳技术 优点： 第三节 琼脂糖凝胶电泳 概念: 对蛋白质的吸附系数极微 琼脂糖作为支持体有均匀、区带整齐、分辨率高、重复性好等优点 电泳速度快 透明而不吸收紫外线 区带可染色， 样品易回收，有利于制备 琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为凝胶支持体的电泳技术。琼脂糖就是从琼脂中提取有D-半乳糖和3、6-脱水-L半乳糖结合的链状多糖。 第三章 电