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高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) ; 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 ;2．高效液相色谱法与气相色谱法比较 ;§ 2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素;§3高效液相色谱法的主要类型及分离原理;分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。 所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。; ; 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相液－液色谱和反相液－液色谱。 采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液－液色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相液－液色谱。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。 ;2.液一固色谱法（液一固吸附色谱法）(LSAC);分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附: Xm + nSa = Xa + nSm ; ;固定相 ;流动相 ;3.离子对色谱法（IPC） ;4. 离子交换色谱法（IEC） ;5.离子色谱法（IC） ;通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生反应：;R－H+＋Na+OH -→R－Na十H2O R－H+＋Na+Br-→R－Na＋H+Br- 由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量???转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阴离子转变成相应的酸，由于H+离子的淌度为Na+离子的7倍，提高了所测阴离子电导的检测灵敏度。对于阳离子样品也有相似的作用机理。 ;在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。 后来，Frits等人提出采用非抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导率极低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。;6. 空间排阻色谱法（SEC）; ;22; 空间排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点： （1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。 (2)保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器 （3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长 （4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10％才能得以分离。 ;7.亲和色谱法（AC）; ;26;§ 5 液相色谱法流动相;（3）适宜的溶解度 (4)低粘度 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离. ; （5）溶剂要与检测器匹配。 对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。;30;§6高效液相色谱仪;32;33;检测系统 ; ;36;37;§ 7 高效液相色谱分离类型的选择 ; 用液一固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。 ;