抗体的检测和纯化 .pptxVIP

抗体的检测和纯化;纯化步骤;抗体 纯化的步骤;一 饱和硫酸铵沉淀法;1,基本原理;2, 操作步骤 ;(二)沉淀 1、样品(如腹水) 20 000 ′ g 离心 30 min ,除去细胞碎片; 2、保留上清液并测量体积; 3、边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中,终浓度为 1 : 1 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜( 4 ° C ),使蛋白质充分沉淀。;(三)透析1、蛋白质溶液 10 000 ′ g 离心 30 min ( 4 ° C )。弃上清保留沉淀; 2、将沉淀溶于少量( 10-20ml ) PBS -0、2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0、2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时( 4 ° C ),每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次,以完全除去硫酸氨; 3、透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。;Protein A/G亲和层析 亲和层析是一种快速有效的生物活性物质的纯化方法,它通过偶联蛋白对目的蛋白选择性的吸收和分离,可取得较高的纯化效果,且操作简便,广泛地应用于实验室抗体纯化。由于产品价格昂贵,使用成本较高,限制了它的运用 ;Protein A A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示特别强的特异性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但IgA , IgM , IgE 也估计结合在配体上,当达到饱和时,一个A 蛋白分子至少能够结合两个IgG分子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特点使之特别适合用于纯化腹水或细胞培养上清中的单克隆抗体 ;Protein G G蛋白是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白,一种三型Fc受体。其通过类似于A蛋白的非免疫机制与抗体的Fc段结合。像A蛋白一样,G蛋白与IgG 的Fc 区域特异性结合,不同的是,Protein G Sepharose 还能够特异性低亲和地与重链的CH1及轻链的Cκ 结合而用于纯化Fab 及F(ab’)2。另外,ProteinG能够广泛、更强地结合许多类型的IgG,多克隆IgG及人IgG,同时血清蛋白结合水平更低,纯度更高,配体脱落也相对更低。;Protein A-Sep harose CL2-4B 亲和层析柱分离提纯IgG;方法;上样　取预处理过的腹水5ml ,用上样缓冲液稀释至50ml ,用0、 45μm 的滤膜过滤,上样,流速为1ml/ min 。 洗脱　用上样缓冲液进行流洗,10 倍柱床体积,流速为1ml/ min 。随后用0、 02M ,p H 4、 0 的柠檬酸缓冲液洗脱抗体,同时应用A KTA explorer100 进行监测,当观察到基线开始上升,即出现洗脱峰时,取干净的4ml 离心管收集,每收集3ml 后,马上用1M ,p H 9、 0 的TRis2Hcl 缓冲液调整p H 值至7、 0 。;平衡　收集洗脱液至洗脱峰回到基线后,接着用上样缓冲液平衡5～10 倍柱床体积,流速调至1ml/min 。再用三蒸水平衡10 倍柱床体积。 7 电泳鉴定 采纳SDS 不连续丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PA GE) ,浓缩胶和分离胶浓度分别为120g/ L 和50g/ L ,每槽加样10μl ,考马斯亮蓝R250 染色。 ;层析图及电泳结果;MabSelect 系列——大规模抗体纯化亲和层析介质;精度纯化;建议的工艺;中空纤维膜技术进行澄清;层析精细纯化技术:;CaptoAdhere;CaptoAdhere;将Mabselect SuRe和Capto Adhere相结合进行两步层析纯化。Mabselect SuRe能够达到99%的抗体纯度,亲和洗脱峰使用Capto adhere的流穿模式进行精纯: 使抗体分子流穿而聚集体、宿主蛋白、脱落的蛋白A配基等杂质结合在Adhere柱上加以去除。如此仅用两步层析就能够得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品,大大缩短了工艺时 间,提高生产效率,同时增加了收率,降低了生产成本。; 完善工艺整合中的其它问题;1, 核酸和内毒素的去除。 ;2, 脱落亲和配基 (蛋白A) 的去除。 a,阴离子交换层析是去除蛋白A-IgG复合物。 b,阳离子交换层析也能够去除蛋白A配基 。 3,抗体制品的病毒去除/灭活及验证。 低pH孵育、加热、S/D (溶剂/去污剂)、纳滤等 ;特异杂质含量验证;单克隆抗体的浓缩;ELISA ;1、　ELISA的原理 2、　ELISA的类型 3、　试剂准备:免疫吸附剂 结合物 酶底物的准备 4、　对比设定 5、　标本的采取和保存 6、　结果判断 ; ELI