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高效液相色谱法 思考题与习题 1．简述高效液相色谱法与气相色谱法的主要异同点。 相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离与分析功能，均 可以在线检测 不同点： 分析对象及范围 流动相的选择 流动相为有限的 操作条件 能气化、热稳定性 几种“惰性”气体，只 GC 好、且沸点较低的样品， 加温常压操作 起运载作用，对组分作 占有机物的 20% 用小 溶解后能制成溶液 流动相为液体或 的样品，高沸点、高分 各种液体的混合。它除 室温、高压下 HPLC 子量、难气化、离子型 了起运载作用外，还可 的稳定或不稳定化合通过溶剂来控制与改 物，占有机物的 80% 进分离。 进行 2．离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有 何区别？ 离子色谱法(Ion Chromatography) ：用离子交换树脂为固定相，电解 质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器。试样组分在分离柱与抑制柱 上的反应原理与离子交换色谱法相同。离子色谱法是溶液中阴离子分析的最 佳方法，也可用于阳离子分析。 第 1 页 反相离子对色谱法(IPC 或 PIC) ：反相色谱中，在极性流动相中加入离 子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加 k 与 t ，以改 R 善分离。适用于较强的有机酸、碱。 反相离子抑制色谱：在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相 pH 值，抑制组分解离，增加其k 与 t ，以达到改善分离的目的。适用于极弱酸 R 碱物质（pH=3~7 弱酸；pH=7~8 弱碱；两性化合物） 3．速率理论方程式在 HPLC 中与在 GC 中有何异同？如何指导 HPLC 实验 条件的选择？ 解:液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动的流动相传 质、滞留的流动相传质以及柱外效应。 在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相色谱中径向扩散的影响较 弱，往往可以忽略。另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流动相传质 及柱外效应。 在高效液相色谱中，对液液分配色谱，Van Deemter方程的完整表达形 式为 由此，HPLC 的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低 粘度流动相，流速不宜过快；③柱温适当。 4．试讨论影响 HPLC 分离度的各种因素，如何提高分离度？ (1) 色谱填充性能 液相色谱柱分离性能的优劣，是由固定相粒度、柱长、由柱内径与填充 状况决定的柱压降这三个参数度决定的。这三个参数度也决定了样品组分的 保留时间，保留时间不仅与色谱过程的热力学因素 k 有关，还直接与决定柱 效与分离度的柱性能参数及流动相的黏度有关，这些参数都是影响色谱分离 过程动力学的重要因素。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要 求非常高的工作，一般都是购买商品柱，很少自行制备。 (2) 流动相及流动相的极性 液相色谱中，改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接因素。液相色 谱不可能通过增加柱温来改善传质。因此大多是恒温分析。流动相选择在液 第 2 页 相色谱中显得特别重要，流动相可显著改变组分分离状况。 (3) 流速 流速大于 0.5 cm/s时，H～u 曲线是一段斜率不大的直线。降低流速， 柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度与出峰时间 的重要可选择参数。 5．指出苯、萘、蒽在反相色谱中的洗脱顺序并说明原因。 三者极性顺序从大到小是苯、萘、蒽，因此在反相色谱中的洗脱顺序为苯、 萘、蒽，苯最先出峰。 6．宜用何种 HPLC 方法分离下列物质？ 2+ 2+ （1）乙醇与丁醇；（2）Ba 与 Sr ；（3）正戊酸与正丁酸；（4）相对分子 质量的的葡糖苷。 （1）正相键合相色谱法 （2）离子交换色谱法 （3）离子对色谱法 （4）空间排阻色谱法 7．外标法测定黄芩颗粒中的黄芩苷的质量分数。 8．内标校正因子法计算炔诺酮与炔雌醇的质量分数。 9．测定生物碱试样中黄连碱与小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱与小檗 碱对照品各 0.2000g 配成混合溶液。测得峰面积分别为 3.60×10 与 4.04×10 V·s。称取 0.2400g 内标物与试样 0.8560g 同法配 制成溶液后，在相同色谱条件下测得峰面积为 4.16×10 , 3.71×10 5 , 3.43 ×10 5 5 5 5 与 4.54×10 5 V·s。计算试样中黄连碱与小檗碱的质量分数。 （黄连碱 26.2%，小檗碱 27.3%） n 10．用 15cm 长的 ODS 柱分离两个组分。柱效 =2.84×10 m ；测得 4 –1 t k α R =1.31min；组分的t 4.10min；t =4.45min。(1)求 k1、 、 、 值。 0 2 R R