2019年简并引物设计.pdfVIP

简并引物设计的方法 简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。 主要 用来同源克隆未知的基因，或用来分析某一种基因多态性的一种方 法。简并引物设计的常见程序如下： 1. 利用 NCBI 搜索不同 物种中同一目的基因的 蛋白或 cDNA 编码的氨基酸序列 。 因为密码子的关系， 不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相 同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用 NCBI 的 Entrez 检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用 BLASTp( 通过蛋白查蛋白 ) ，在整个 Nr 数据库中中查找与之相似的氨 基酸序列。 2. 对所找到的序列进行多序列比对。 将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对， 最好采 用局部比对程序如 BLOCK ，网址：http://bioinformatics.weizmann.a ... ww/make_blocks.html 。也可选工具有 Clustal W 。 3. 确定合适的保守区域。 设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域， 且两个保守区域 相距 50～400 个氨基酸 为宜，使得 pcr 产物在 150~1200bp 之间， 最重要的是每一个保守区域至少有 4 个氨基酸。若比对结果保守性不 是很强很可能找不到 4 个氨基酸的保守区域 ，这时可以根据物种的亲 缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对， 若保守性仍达不到要求， 则需进行三次比对。总之， 究竟要选多少序列来比对，要根据前一次 比对的结果反复调整。 最终目的就是至少有两个 4 个氨基酸且两者间 距离合适的保守区域。 4. 利用软件设计引物。 当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用 primer 5.0 进行设计。但最好使用专门的简并引物设计的方法如： CODEHOP （网址： http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html ）， GeneFisher2 （网址： http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/ ）。 在这里我们特别值得说明的是 CODEHOP 方法，该方法要求的保守 区较短，而且能有效的降低引物的兼并度，是一种非常有效的方法。 该方法主要是 通过将简并区放在 3 ′末端，并在 5 ′端设计一个一致性的 区域来降低兼并度 ，详见 /thread-8194-1-1.html 。 5. 对引物的修饰 若得到的引物为： 5-NAGSGNGCDTTANCABK-3 ，则其简并度＝ 4 ×2 ×4 ×3 ×4 ×3 ×2=2304 ，很明显该条引物的简并度太高不利于 pcr 。 我们可以 通过用次黄嘌呤代替 N （因为次黄嘌呤能很好的和 4 种碱基 配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度 （有个查密码 子偏好的数据库网址： /viewthrea ... ht=%C3%DC%C2%EB%D7% D3 ）。 注意：该方法设计出来简并引物对， 适用于用于比对的