siRNA设计原则分析和总结.pdfVIP

量实验表明，针对同一靶基因的不同 siRNA 序列具有不同的沉默效率，为了能够运用 RNAi 技 术更有效地沉默靶基因， 需要在 RNAi 的第一步， 也是其成功与否的关键环节 ―siRNA 序列的设 计方面进行更多的改进。本文将在以下几个方面探讨 siRNA 序列设计方面的最新研究进展，作 为应用 RNAi 技术时的参考。 RNAi 最终要通过 siRNA 片段与靶基因结合并使之降解， 因此， 确保高度同源于靶基因而绝无与 其他基因同源的 siRNA 序列，是决定 RNAi 特异性的关键所在，也是 siRNA 设计的基本原则。 从具有不同沉默效率的 siRNA 序列中筛选出高效的 siRNA 序列， 需要经过严密的设计和不断的 实验检验 [1] 。 1.siRNA 序列在靶基因中的位置 从靶基因起始密码子 AUG 下游 50 ～ 100 个核苷酸开始搜寻理想的 siRNA 序列，越靠近靶基因 的 3′端，其基因沉默效果可能越好 [2] 。以前的研究表明：不要以 5′非翻译区（ 5′UTR）和 3′非翻 译区（ 3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计 siRNA 的模板，这些区域含有调节蛋白结合位 点( 如翻译起始复合物 ) ，调节蛋白可与 RISC 竞争结合 siRNA 序列，降低 RNAi 效应 [3] ；也要避 开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性 (SNP) 区域。最近， Yokota 等发现在 HCV( 丙型 肝炎病毒 )基因组中， 5′UTR是一个高度保守区，使之成为 siRNA 理想的靶点。运用 RNAi 技术 作用于 5′UTR或 3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默 [4,5] ，这些发现使基因功能分析领域扩展 到 5′UTR和 3′UTR内。 2. siRNA 序列的起始碱基与长度 SiRNA 序列最好为 AA(N n)UU(N 代表任意碱基； n 为碱基数目， 在 19 ～29 nt 之间 )， NA(N n) UU 和 NA(N n) NN 序列也可以。 以前的研究表明， 典型 siRNA 的三大结构特征是： 长度为 21 ～ 23 nt ；siRNA 双链的 3 ′端各有两个突出碱基； siRNA 双链的 5 ′端有磷酸基团。以 AA?N19 标准 设计的 siRNA ，在哺乳动物细胞中 70% ～80% 可产生 RNAi 作用。但是一些具有较小脱靶效应 的 siRNA 序列不是以 AA 为起始的，所以现在不推荐以 “AA为起始 ”作为选择标准之一 [6] 。最新 研究表明 [7,8] ，27 nt 或 29 nt 的 siRNA 与 21 nt siRNA 相比：（1 ）其抑制活性可提高数倍以上； （2 ）不易于诱导干扰素反应和激活 PKR ；（3 ）一些基因对 21 nt siRNA 不敏感，但是可以被 27 nt siRNA 有效的抑制； （4 ）与 21 nt SiRNA 相比， 27 nt SiRNA 对靶基因的最大抑制率可在 相对低的浓度下得到。另外，在选择 siRNA 序列时，要考虑到所用启动子的类型。 U6 启动子 要求转录产物的第一个碱基是 G ，正反义链均如此； H1 启动子转录产物的第一位碱基为 U 、G 、 C 均不影响基因的沉默效果 [9] 。 3 .siRNA 3 端突出碱基的选择′ 当 siRNA 的 3′端突出碱基为 UU 时，其基因抑制效率最高；但是 3′端的突出碱基不能为 G ，因 为 RNase 会降解以 G 为末尾的 RNA 单链。 Elbashir 等［ 2 ］建议用 dTdT 取代 3′端的 2