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PCR 常见问题总汇 PCR 产物的电泳检测时间 一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h 后带型不规则甚致 消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR 反应的关键环节有① 模板核酸的制备，② 引物的质量与特异性，③ 酶的 质量及， ④ PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质， ②模板中含有 Taq 酶抑制剂，③模板中蛋白 质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多， 或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极 有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳 定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活： 需更换新酶， 或新旧两种酶同时使用， 以分析是否因酶的活性丧失 或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或 扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两 条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：① 选定 一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做 琼脂糖凝胶电泳， 一定要有引物条带出现， 而且两引物带的亮度应大体一致， 如 一条引物有条带，一条引物无条带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单 位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③ 引物应高浓度小量分装保存， 防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分， 导致引物变 质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+ 浓度： Mg2+ 离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 P CR 扩增的特 异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不 出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul 、30ul 、50ul 。或 100ul ，应用多 大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定， 在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短， 极有可能出现假阴性 ;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率 退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标 准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是 PC R 失败的原因之一。 靶序列变异： 如靶序列发生突变或缺失， 影响引物与模板特异性结合， 或因 靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。 假阳性 出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更 高。 引物设计不合适： 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性， 因而在