HRM实验指导分析和总结.pdfVIP

高分辨熔解曲线分析技术 高分辨熔解曲线分析技术， high resolution melting ，简称 HRM ，是近几年 来在国内外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。 它是一 种高效稳健的 PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限， 无需序列特异性探针， 在 PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性 -SNP、甲基化、基因分型等分析。 HRM 的主要原理是根据 DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异， 应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析， 其极高的温度均一性和温度分辨率使 分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。 同许多荧光 PCR 技术一样，HRM 是 利用了特定的染料可以插入 DNA 双链中的特性， 通过实时监测升温过程中双链 DNA 荧光染料与 PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样 品进行检测。 实验前准备 在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如： PCR检测用到的罗 氏的LightCycler? 480 Control Kit 和High Resolution Melting Master等。 High Resolution Melting Master中含有 2 × Master Mix( 包含热启动 Taq DNA Polymerase 反应缓冲液， dNTP mix ，高分辨率染料 ),25mM MgCl 2 ，PCR级别的 H2O，用于调 整反应的最终体系。 本次实验所涉及到的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的单道移液器、 QSP 盒装吸头、冰盒，罗氏的 LightCycler? 480 ，还有常规的离心机、水浴锅等。 HRM 体系配制 实验中用到的 HRM 试剂盒需要对 MgCl 2溶液进行最近的浓度确认，以一管 DNA 样品为例展开实验。 先加入 1 号管的 2 × Master Mix 165 μl，再加入 9 号管的 primer mix 33 μl，最 后加 8 号管的 mutation 突变体 33 μl，混匀，瞬时离心，分装到相对应的管中。 分装好做 mutation 样品的 Mg2+浓度，以第1第2管来演示配制 3.3倍体积加样。 在 1管中加入 4 μl MgCl ，再加入 16 μl水。同样地，在 2管中加入 5.3 μl MgCl 2 2 和 14.5μl水，其他管按照对应的体积配制即可。同时根据说明书配制好 WT 野 生型和 Het 杂合子的样品。注意在配制过程中要吹打混匀。 配制好反应体系后，各吸取 20 μl于96孔板中，设置 3个重复。上样完毕，盖 上盖板膜，确保其密封性。将 96孔板放入 LightCycler? 480进行 HRM 的 QPCR 实验。 程序设置 打开软件，在 New Experiment 界面下进行反应条件设定。 样品体积为 20 μl， 预变性 95°C 5min，无需采集荧光。在扩增反应中，设置45个 Cycles，变性95°C 10s， 退火 65°C 10s，延伸 72°C 20s 并收集荧光。设置溶解曲线，各参数如屏幕所示。 设置完毕后，即可点击保存，并开始 PCR 反应。 样品编辑 点击 Sample Editor 进入样品编辑，选择 Scanning模式。选中相同的样品孔， 设置名称和类型，点击 Make Replicates 设为复孔。按照此方