比色法测定苹果中可溶蛋白质含量.pptxVIP

会计学 1 比色法测定苹果中可溶蛋白质含量 2 1 实 验 准 备 2 实 验 实 施 3 结 果 分 析 4 结 论 第1页/共17页 3 实验准备 果蔬可溶性蛋白质含量是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控。因此，果蔬组织可溶性蛋白含量的测定就显得尤为重要。 第2页/共17页 4 实验准备 实验原理 考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下时最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 第3页/共17页 5 实验准备 实验原理 第4页/共17页 6 实验准备 考马斯亮蓝法 优点：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少 缺点：去污剂、、十二烷基硫酸钠等干扰测定；标准曲线有轻微非线性 第5页/共17页 7 实验实施 主要仪器及试剂：分光光度计；电子天平; 容量瓶 25ml十个； 50ml 烧杯2个；BSA 新鲜苹果 ；Tris、外援添加物等 第6页/共17页 8 实验实施 (1)试剂的配制： ·标准蛋白溶液的制备：配制100μg/mL的BSA溶液 ·提取缓冲溶液：pH 7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8和9.0梯度Tris-HCl缓冲液(100mmol/L) ·梯度浓度Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)：10、30、50、80、100mmol/L ·外援添加物：EDTA(1mmol/L)、PVP(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、、半胱氨酸(2mmol/L)、β-巯基乙醇(2%，V/V) 第7页/共17页 9 实验实施 （2）实验操作步骤 称取苹果果肉1g 加入不同缓冲液5mL，研磨 离心，取上清液8mL 低温保存 第8页/共17页 10 实验实施 实验操作步骤 开启分光光度计，预热20分钟 标准溶液吸光度的测定 标准曲线的绘制 待测液的测定 第9页/共17页 11 结果分析 表一：不同吸光度值对应BSA含量 BSA含量µg 0 20 40 60 80 100 吸光度A 0 0.144 0.268 0.366 0.447 0.541 线性回归率为0.9990，线性方程y=186.33X-4.8440 。 第10页/共17页 12 结果分析 不同缓冲体系对可溶性蛋白提取效果的影响 1.不同缓冲液及其pH 1-11分别代表水、pH为7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0的Tris-HCl缓冲溶液 第11页/共17页 13 结果分析 2.不同浓度 1-6分别表示浓度为0、10、30、50、80、100mmol/L的pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液 第12页/共17页 14 结果分析 3.不同外援添加物 A-J分别代表抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巯基乙醇、NaCl、MgCl2、PVP＋β-巯基乙醇、PVP＋EDTA、EDTA＋PVP＋β-巯基乙醇 第13页/共17页 15 结果分析 苹果组织可溶性蛋白质含量的测定 项目 吸光度 蛋白含量μg 蛋白含量% 平均值% 1 0.260 43.60 34.88 34.93 2 0.263 44.16 35.33 3 0.258 43.23 34.58 第14页/共17页 16 结论 实验最终确定的适用于苹果果实可溶性蛋白含量测定的提取条件为，0.1mol/L,pH为9.0的Tris-HCl提取缓冲液(内含1mol/LEDTA和1%PVP)，此条件下，果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.93%（mg/g） 第15页/共17页 17 感谢学校给予我们这次宝贵的机会！ 感谢老师们的帮助！ 请老师和同学批评指正！ 第16页/共17页