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PCR产物回收 酶切鉴定 pcr产物回收酶切鉴定 PCR产物回收期；酶消化鉴定 pcr产物回收、酶切鉴定 1.1实验目的 1.掌握pcr产物回收和酶切鉴定的基本原理 2.熟悉PCR产物回收和酶切鉴定的具体操作流程 3.鉴定β-珠蛋白基因（β-gbobingene）多态性 1.2实验原理 1.2.1pcr产物回收实验原理 PCR产物通常含有过量的引物、Taq DNA酶和dNTP。这些组分的存在将直接影响后续的酶切和双脱氧PCR测序反应，因此有必要去除它们。目前，核酸纯化的方法很多。回收试剂盒的出现使DNA纯化过程更加简单和快速。 试剂盒pcr回收原理：试剂盒中回收管内所带的硅基质膜，具有在高盐、低ph值情况下吸附dna，低盐、高ph值情况下释放dna的性质。 1.2.2酶消化实验原理 限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链dna序列的一种内切核酸酶。β-珠蛋白基因pcr产物中含有avaⅱ酶切位点，会被avaⅱ酶切割。 1.3方法步骤 1.3.1pcr产物纯化操作步驟 1.将PCR反应产物转移至干净的1.5ml离心管中。 2.加入3倍体积的bindingsolution至反应产物溶液 （50μL PCR溶液，添加150μL的结合液并振荡（均匀混合） 3.将spincolumn放入collectiontube中，将反应溶液放入spincolumn中，以12,000×g离心1分钟，丢弃collectiontube中的液体。 4.加入700μL的洗涤液，日期为12000×G离心机1分钟。丢弃废液并重复此步骤一次。 5.丢弃废液，12,000×g离心去除残余的酒精。 6.将旋转柱转移至新的1.5 ml离心管中，向柱中添加30μL的溶液或H2O（pH7.0~8.5），并静置2分钟。 7.12,000×g离心2分钟。 1.3.2ava II酶消化反应步骤 分别将20μldna、1μlavaii、5μl10×buffer、24μlh2o加入1.5ml离心管中混匀，37℃反应30min 1.5讨论和分析 除了214bp/790bp/1004bp/1116bp条带外，其他为杂带。由于片段太小，214bp条带无法显示，只有第10组可以看到。但由于第2、10、18、23、24组的790bp、1004bp和1116bp的条带可以识别，故认为这些组别的酶切位点表型为β-gg1/2(b1/b2)。 由于以下原因，某些组（6、9、11、12、13、14、15、cm、JW、HP）的谱带较弱，甚至无法识别： 1.dna的上样量不够 2.DNA降解 3.dna走出凝胶 4.对于EB染色的DNA，光源不合适 上述问题对应解决办法是： 1.增加DNA样本量，琼脂糖电泳灵敏度低于聚丙烯酰胺凝胶电泳，样本大小合适。 2.避免dna的核酸酶污染 3.缩短电泳时间，降低电压，提高凝胶浓度。 4.应用短波长（254nm）的紫外光源 然而，根据第10组的清晰酶消化鉴定结果和其他结果，可以推断原因3和4不太可能存在。这很可能是由于DNA样本采集不足造成的。