蛋白质的研究方法与原理讲课文档.pptVIP

原理：用异硫氰酸苯酯（PITC）与待分析多肽的N-端氨基在碱性条件下反应，生成苯氨基硫代甲酰胺（PTC）的衍生物，然后用酸处理，关环，肽链N-端被选择性地切断，得到N-端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接着用有机溶剂将该衍生物萃取出来，酸作用下，该衍生物不稳定，会继续反应，形成一个稳定的苯基乙内酰硫脲（PTH）衍生物。余下肽链中的酰胺键不受影响。通过用HPLC或电泳法分析生成的苯乙内酰硫脲（PTH-氨基酸），可以鉴定出是哪一个氨基酸。每反应一次，结果是得到一个去掉N-端氨基酸残基的多肽，剩下的肽链可以进入下一个循环，继续发生降解。 现在六十页，总共一百一十六页。 优点： 能够可靠地测定肽链的30个左右氨基酸残基序列，最多可以分析50-60个氨基酸残基。在最好的条件下，每形成一次PTH-氨基酸，效率可保持在99%以上。而且此法用量少， 缺点： 由于Edman降解是以化学试剂对N-端氨基的修饰为基础的，因此当N-端被其他化学基团所封闭时，就需要先去除这些基团，然后才能进行测序。此外，蛋白质中含有半胱氨酸残基时，有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联。这种情况下，需要先用过酸将二硫键氧化为–SO3H，然后才能用Edman降解测定序列。 现在六十一页，总共一百一十六页。 2. 质谱法 质谱技术－－基于串联质谱技术的氨基酸测序方法是根据质谱技术测定多肽分子质量的极高准确性这一特点而设计的 。 ①先测定某一肽段（如：A-B- C-D-E-F-G-- ）以及从C-末端或N-末端去除一个残基的同一肽段（如：B-C-D-E-F-G-）各自的分子质量，二者之差值即为末端残基（A）的分子质量。 ②然后与20种标准氨基酸的分子量进行比较就可以确定末端氨基酸的本质了。 测定时： 现在六十二页，总共一百一十六页。 实际操作时： 从质谱上得到的是一系列的多肽片段，每对大小相近的片段之间仅仅相差一个氨基酸残基。 根据这一分子量差值的大小，较大肽段的末端残基即可准确判断。换句话说，从获得的一系列依次相差一个残基的肽段的分子质量中我们很快就可以确定最初样品多肽的末端序列（从N一末端或C一末端开始）。 现在六十三页，总共一百一十六页。 二、蛋白质空间结构分析 （一）X射线衍射晶体分析法 （二）核磁共振法 （三）圆二色谱法 （四）傅里叶变换红外光谱法 （五）生物信息学预测蛋白质空间结构 现在六十四页，总共一百一十六页。 （一）X射线衍射晶体分析法 现在六十五页，总共一百一十六页。 X射线本质 X射线是一种短波长(0.005～10nm)、高能量(2.5×105 ～1.2×102eV)的电磁波。它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。 现在六十六页，总共一百一十六页。 X-射线晶体结构分析基本原理 X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象 X射线衍射现象利用X射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。 当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。 衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有序或无序的排列等。 现在六十七页，总共一百一十六页。 （二）核磁共振法 1946年美国斯坦福大学的F.Bloch和哈佛大学的两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获1952年诺贝尔物理奖。 1983年，瑞士科学家Kurt Wüthrich教授实验室首次运用核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagon）多肽的溶液构象. 发明了利用核磁共振(NMR)技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了2002年度诺贝尔化学奖 现在六十八页，总共一百一十六页。 NMR基本原理 核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance)， 就是处于某个静磁场中的自旋核系统受到相应频率的射频磁场作用时 ,共振吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程。 核磁共振波谱是测量原子核对射频辐射(约4?600MHz)的吸收，这种吸收只有在高磁场中才能产生。 核磁共振波谱仪 现在六十九页，总共一百一十六页。 核磁共振法中几个常用的参数 化学位移 耦合常数 NOE（核欧沃豪斯效应）信号强度 谱峰面积 弛豫时间 现在七十页，总共一百一十六页。 （1）化学位移 δ 值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在低场；δ 值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出现在高场。 现在七十一页，总共一百一十六页。 （2）耦合常数 核与核之间以价电子为媒介相互耦合引起谱线分裂的现象称为自旋裂分。由于自旋裂分