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目的基因获取目的基因第1页/共29页研究某基因与疾病的关系编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系准备要分离、改造、扩增或表达的基因。第2页/共29页一、基因的基本结构特征 一个能转录、翻译的结构基因依次包括以下几部分：转录启动区、核糖体识别区、编码区(包括起始密码子ATG、开放阅读框、终止密码子TAG、TAA或TGA)和转录终止区。第3页/共29页（一）原核生物基因的组成——操纵子启动子：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段；SD区：糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置；转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。第4页/共29页（二）真核生物基因的组成基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区：TATAA/TA区（Hogness框）、 CAAT框、GC框。转录终止区:真核生物转录的终止信号并不清楚。二、目的基因的获得方法第5页/共29页目前克隆目的基因常用的方法有四种方法：化学合成法、cDNA文库法、PCR法和RT-PCR法 。（一）化学合成法第6页/共29页将已知序列的目的基因利用化学合成的方法直接合成。特点：①只能合成小于100个碱基特定序列；②自动化程度较高；③合成速度较快。 方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法第7页/共29页化学合成法的用途合成天然基因：如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等修饰改造基因：如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等设计新型基因制备探针、引物、接头第8页/共29页（二）cDNA文库法cDNA (complementary DNA，互补DNA)：由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。第9页/共29页基因组DNA文库与cDNA文库的比较cDNA文库基因组DNA文库第10页/共29页构建cDNA文库的一般步骤总RNA（total RNA）提取提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料2. mRNA的分离纯化第11页/共29页原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 方法：亲和层析。分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。 第12页/共29页3. cDNA第一链的合成第13页/共29页Oligo dT法：用Oligo dT作引物，合成cDNA的第一链。 3’ AAAAAAA5’ mRNA反转录酶TTTTTTT5’ cDNA不适用于大分子量的mRNAOligo dT引物第14页/共29页随机引物法：随机合成6-10bp的多种引物，从mRNA的多个位点开始合成cDNA。基因特异性引物法：mRNA序列已知，设计基因特异性引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链。4. 降解mRNA模板第15页/共29页用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。3’ 5’ mRNA5’ 反转录酶引物cDNA3’ 3’ 5’ mRNA5’ 引物cDNA第一链3’ 碱或RNaseH5’ 3’ 引物cDNA第一链5. cDNA第二链的合成第16页/共29页自身引导法用RnaseH 消化后，cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。第17页/共29页 S1核酸酶消化会使获得的双链cDNA 5’端有几对碱基缺失第18页/共29页置换合成法 以第一链合成产物cDNA-mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物，在DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.置换合成法第19页/共29页第20页/共29页6. cDNA与载体连接在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。接上人工接头粘性末端CCC末端转移酶CCC第21页/共29页cDNA文库的查询第22页/共29页文库载体探针测序分析电泳后杂交放射自显影用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern