流式细胞仪常用的几种检测方法.docxVIP

流 式 细 胞 仪 常 用 的 几 种 检 测 方 法 （ 转 载 ） 一、测定用乙醇固定的DNA 的含量 1、培养细胞的 DNA 含量的测定 制备单细胞悬液于 200μl 的PBS 缓冲液中； 加入 2ml 预冷的 70%乙醇， 4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液 1～2×106 个细胞于PBS（PH=）缓冲液中； 2) 300g 离心 5 分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于 PBS 缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于 2～3ml冷 70%乙醇中，混匀，保存于 4℃，至少 30 分钟。在 4℃条件下可保存 2~3 周。 注意： 2 根据实验的要求，固定剂也可选用 1～3%多聚甲醛； 2 将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至 0～4℃ ； 2 细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断 震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g 离心 5 分钟，去上清，再重悬于400μl PBS 中； 2 显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2 加入PI （含 Rnase），避光孵育 30 分钟； 2 上机检测。 2、新鲜组织的 DNA 含量的测定 1) 用 200mg 湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g 离心 5 分钟； 3) 弃上清，重悬于 10ml 染色-去污剂中； 4) 再过滤，用 200 目的筛网或 70~80μm 的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的 DNA 含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片 50 μm 厚， 2~3 片， 制成单细胞悬液； 2) 用PBS 缓冲液洗涤， 500g 离心 5 分钟，弃上清； 3) 加入PI 液 1ml 室温避光 30 分钟； 4) 调整细胞浓度为 1×106/ml ；5) 上机检测。 二、细胞凋亡 检测及相关分子检测 1、细胞 DNA 含量分布（由细胞DNA 降解方式检测细胞凋亡） 2 收集已固定的单细胞悬液约 5×105~1×106/ml ； 2 离心除去固定液， 3ml PBS 重悬细胞; 2 1500rpm 离心， 5 分钟 ，弃去 PBS ； 2 加PI 染液 1ml，室温避光 20 分钟； 2 调整细胞浓度 5×105/ml ； 2 上机检测。 2、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡 1) 常规制备单细胞悬液,用PBS 洗两次.(若为全血要先溶 血),取约 5×106 个细胞， 1500rpm 离心,弃上清,用 400μl 1×Binding Buffer 重悬； 2) 分成 a、 b、 c、 d、 e 五管，每管约 1×106 个细胞 a) 阴性对照，不加任何试剂； b) 阳性对照,加 2%多聚甲醛固定 30 分钟,加AnnexinV 5μl,室温 10min,用 1×Binding Buffer 洗一次,弃上清再加 190μl 缓冲液、 10μl PI 避光 15 分钟 c) 加 10μl PI，避光孵育 15 分钟； d) 加 5μl AnnexinV 液，室温避光孵育 15min ； e) 加 10μl PI 和 5μl AnnexinV 液，室温避光孵育 5min ； 3) 每管各加 400μl 1×Binding Buffer。 4) 上机检测。 注意 a. 操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞； b. 操作时注意避光； c. 反应完毕后尽快检测，最好在一小时内检测。 3、用单克隆抗体检测细胞凋亡 1) 放置~1×106 个细胞到试管中； 2) 室温离心 200g， 6min ； 3) 弃上清，加入 100μl 冷的（4℃）在 PBSF 溶液中含 100μg/ml 的 digitonnin，轻 轻地重悬细胞，在冰上孵育 20min ； 4) 加入 2ml 冷的（4℃） PBSF 液，室温离心 200g， 6min ； 5) 弃上清，加入 20μl PE 标记的 单克隆抗体和 80μl PBSF 液，用vortex 轻轻震 荡，室温避光孵育 15 分钟； 6) 加入 2ml PBSF 液，室温离心 200g， 6min ； 7) 弃上清，加入 1ml PBSF 液重悬细胞； 8) 避光保存，直到流式细胞仪检测。 PBSF ：含% FCS（v/v）和%NaN3（w/v）的 PBS。 三、用流式细胞术进行 DNA 周期分析 1、方法：同 DNA 含量检测 2、注意： 单细胞浓度应约 106/ml，以免影响检测的 CV 值和检测结果； 制备完成后的标本应用光学显微镜检查其