端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验.docVIP

端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验 文档信息 主题： 关于“医学心理学”中“肿瘤学”的参考范文。 属性： Doc-02APGP，doc格式，正文7482字。质优实惠，欢迎下载！ 说明： 作为医学资料、肿瘤学资料的写作参考资料，提供解决怎么写及格式等相关问题。 适用： 作为文章写作的参考文献，解决如何写好实用应用文、正确编写文案格式、内容摘取等相关工作。 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验 2 0 引言 2 1 材料与方法 2 2 结果 4 3 讨论 7 文2：端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞生长的影响 9 1 材料与方法 9 1．2 方法 9 2 结 果 10 3 讨论 11 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验 文1：端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验 0 引言 我国为肝癌高发国家，据统计肝癌位居男性肿瘤患者死亡原因的第二位［1］。肝癌的发生发展与端粒酶激活密切相关。端粒酶由三部分组成，即端粒酶rna、端粒酶逆转录酶和端粒酶相关蛋白。端粒酶在行使其功能合成染色体末端端粒序列时必须以自身的rna为模板［2］。端粒酶rna由450 个核苷酸组成，其中11个核苷酸为端粒合成的模板序列。我们设想，封闭端粒酶rna的模板序列，干扰端粒酶向染色体末端添加端粒序列的过程， 使癌细胞端粒长度的稳定机制破坏，就可使永生化细胞的癌细胞无限增殖受限，从根本上抑制肿瘤细胞生长。，为肝癌治疗探索一条新的、有效的途径。 1 材料与方法 材料 细胞株 肝癌细胞株smmc27721，正常肝细胞株l202，购自中科院上海细胞生物技术研究所。 trap反应试剂、tunel检测试剂、western单抗为宝灵曼公司产品。 聚丙烯酰胺银染试剂 硝酸银(agno3)，无水碳酸钠(na2co3)，购自华美生物公司。 仪器 beckman cs215r低温离心机，perkin2elmer gene pcr仪，mk22酶标仪。 方法 端粒酶反义dna的设计 选择近端粒酶 rna 模板区的20个核苷酸为反义靶位，设计合成端粒酶反义 dna 序列、正义序列、随机序列，见表1。硫代反义dna由中科院上海细胞所合成与纯化，纯度达98%以上。 表1 端粒酶模板区反义、正义及随机序列（略） tab 1 the sequence of see， anti2see and control2scrabled trap2pcr2elisa检测肿瘤细胞端粒酶活性［3］ 合成dna对肝癌细胞端粒酶活性的影响 1×106 smmc27721培养于nunclon 24 孔板，培养液1ml含10% 热灭活小牛血清、50u/ml青霉素、50μg/ml链霉素，培养条件为37℃、5% co2 。正义、随机、反义dna终浓度为10μmol/l，以pbs为对照，作用时间分别为12、24、36、48、60h，培养结束后胰酶消化，pbs洗2次，trap2elisa法定量测定端粒酶活性，每一dna设3复孔。进一步观察倍比稀释后的端粒酶反义dna（浓度为10、5、、μmol/l）作用不同时间对细胞端粒酶活性的影响。 凋亡研究 (1)tunel染色观察细胞染色及细胞调亡 4×105/ml培养细胞种植于12孔细胞培养板，不同寡核苷酸作用14天后pbs洗涤2次进行细胞爬片，按tunel试剂盒说明对细胞进行固定、通透、标记反应，苏木素染色，封片，拍照。 (2)流式细胞仪细胞周期分析 1×104细胞经5μmol/l反义dna作用14天的细胞进行细胞周期时相分析。 (3)dna抽提及电泳 将1×106经反义dna作用14天的细胞移入离心管，加裂解液及蛋白酶2k，55℃水浴20min，加rna酶 10μl 作用2min，酚、氯仿2异戊醇各抽提1次，加3m乙酸钠、无水乙醇沉淀dna，3000g离心10min，气干，te溶解沉淀。 取抽提好的dna 5μl，在%琼脂糖凝胶、5v/cm电压下，电泳3h，以hind2 ⅲ酶切的λdna为分子标志，302nm紫外光透照并照相。 western分析细胞周期相关蛋白 收集经反义dna作用14天的smmc27721肝癌细胞（以未作任何处理的smmc27721阴性对照），裂解液裂解，蛋白产物进行sds2page电泳（15%浓缩胶，5%分离胶），电泳产物半干电转移至nc膜上（转移时间p21为45min，cyclind1、cdk2为1h），50g/l脱脂奶粉室温封闭4h，tbs漂洗3次，分别加入抗小鼠cyclind1，抗兔cdk2、p21单克隆抗体及作为内