细胞培养的设备和操作技术.pptVIP

?琼脂:是从海藻中提取的一种高分子碳 水化合物，其主要作用是使培养基在常温下凝固，但不参与代谢。 ?活性炭:主要目的是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，如可以防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。 3、附加物 这类物质为非植物细胞生长所必须，但对细胞 生长有利,主要包括琼脂和活性炭。 当前63页，共89页，星期日。 ? 作用：提供一些必要的微量营养成分、 生理活性物质和生长激素等。 ? 这类物质常指天然提取物 ： ?麦芽提取物、 ?椰乳、 ?鲜果汁、 ?酵母提取物 4、 其它有益有机添加物或未知复合成分 当前64页，共89页，星期日。 5、pH值： 即酸碱度，培养的植物材料大多数要求弱酸性的环境，一般将培养基调整至pH5.6—5.8。常用0.1mol/l氢氧化钠或盐酸来调节培养基的pH。 注意： 第一、经高温高压灭菌后，培养基的pH会下降0.2-0.8,故调整后的pH应该高于目标pH 0.5个单位； 第二、 pH的大小会直接影响到琼脂的凝固能力，一般pH 大于6.0时，培养基就会变硬，低于5.0时琼脂就不能很好地凝固。 当前65页，共89页，星期日。 6、激素 ?在培养基中，其各种成分对培养物影响最大的最显著的就是激素。激素的种类、浓度、以及配比都会显著的影响愈伤组织的形成、不定根、不定芽的分化，胚状体的形成等； ? 组织培养中使用的激素有的是天然的，如脱落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4－D）。 当前66页，共89页，星期日。 （一）、激素的种类 1、生长素 2、细胞分裂素 3、赤霉素 4、脱落酸 当前67页，共89页，星期日。 1、生长素类 ? 生长素是指能引起完整组织中的细胞扩展的化合物。 ?在自然界中，即内生生长素影响茎和茎节的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象 ? 在组织培养中的主要作用是：诱导愈伤组织的产生，促进细胞脱分化，促进细胞的伸长，促进生根。 当前68页，共89页，星期日。 ? 组织培养中常用的生长素有： 二氯苯氧乙酸（2，4－D） ； 萘乙酸（NAA） 吲哚乙酸（ IAA ） ； 吲哚－3－丁酸（IBA） 萘氧乙酸（NOA） ； 对氯苯氧乙酸（P-CPA） 三氯苯氧乙酸（2，4，5 －T）； 生根粉（ABT） NAA 、IAA、 IBA易引起生根， 2，4－D 、2，4，5 －T有利于愈伤组织的诱导和生长。 当前69页，共89页，星期日。 ?主要作用：是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生； ?作用的强弱顺序为： 2，4-DNAAIBAIAA 当前70页，共89页，星期日。 ?溶解方法： 0.1M NaOH或95％酒精，以前者为好 ?保存： 配成一定浓度后，冰箱冷藏保存 当前71页，共89页，星期日。 一、 洗涤技术 ?、洗涤目的：去除杂物，降低带菌量 ?、根据洗涤对象的不同，主要分为： 器皿洗涤（包括玻璃、塑料、搪瓷、 不锈钢器皿） 培养材料洗涤 当前31页，共89页，星期日。 （一）器皿洗涤 根据洗涤对象的具体情况可分为以下三种： 特殊洗涤 微生物大量污染的洗涤 常规洗涤 当前32页，共89页，星期日。 ? 常规洗涤 △ 自来水洗去油渍、霉菌等脏物； △ 温肥皂水中浸泡一定时间后用刷子刷净； △自来水冲洗干净，至瓶壁不挂水珠为止； △ 蒸馏水淋洗内外壁 △ 将玻璃器皿倒置：晾干或烘干（50～75℃） △ 放入除尘柜中备用 当前33页，共89页，星期日。 ? 微生物大量污染的洗涤 △ 微生物污染器皿加压灭菌后再洗涤 特殊洗涤（如沾有蛋白质类物质或其它有机物时) △ 经过常规洗涤未过蒸馏水的器具，浸泡入洗液（铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成）中数分至数小时； △ 回收洗液，器具先用自来水洗净，蒸馏水淋洗，烘干（75℃） 当前34页，共89页，星期日。 （二）、试验材料的清洗 清洗目的：来自自然界的试验材料，包括来自土壤中的幼茎、磷茎，滋生着各种微生物，尤其是细菌的芽孢和真菌的孢子，一旦与培养基接触，就会很快的繁殖起来，造成培养基和培养材料的污染。 清洗方法：先用自来水冲洗5分钟，然后用中性洗涤剂清洗，注意勿损伤试验材料。再用自来水流水冲洗半小时，用于下一