原生质体培养与融合.pptVIP

细胞器移植 细胞核移植 细胞核的来源 植物组织－机械法（加Triton X-100）－过滤离心 原生质体－低渗涨破(加Triton X-100)－过滤离心 细胞核的纯化 Percoll或蔗糖密度梯度离心 细胞核的转移 夹层离心法：原生质体－核－原生质体－核??? PEG诱导 电场诱导和微注射 体细胞杂种产生的其它途径 第61页，共75页，编辑于2022年，星期五 体细胞杂种产生的其它途径 微生物移植 内吞作用 摄入固氮根瘤菌 外源染色体和DNA的摄入 染色体分离 细胞－同步化处理－原生质体－涨破－差速离心（200 g,10 min；1000g，20 min） 转移方法 PEG诱导，显微注射 农杆菌介导，基因抢，电穿孔，超声波，激光穿孔 第62页，共75页，编辑于2022年，星期五 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 根据可见标记性状的机械选择法 第63页，共75页，编辑于2022年，星期五 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 。 FITC(异硫氰酸荧光素)在荧光显徽镜下呈绿色 RITC (异硫氰酸罗丹明) RITC在荧光显徽镜下呈红色 第64页，共75页，编辑于2022年，星期五 质膜稳定剂 目的：增加完整原生质体的数量，防止质膜破坏，促进原生质体细胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。 常用的质膜稳定剂 葡聚糖硫酸钾、2-（N-吗啉）-乙烷磺酸、氯化钙、磷酸二氢钾。 第29页，共75页，编辑于2022年，星期五 原生质体培养方法 第30页，共75页，编辑于2022年，星期五 液体浅层培养法 优点： 原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点： 原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。 第31页，共75页，编辑于2022年，星期五 双层培养法——液体-固体双层培养法 优点： 固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 缺点： 不易观察细胞的发育过程。 第32页，共75页，编辑于2022年，星期五 固体薄层培养法 优点： 使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。 缺点： 培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。 第33页，共75页，编辑于2022年，星期五 琼脂糖珠培养 将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ml一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。 培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育，这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。 第34页，共75页，编辑于2022年，星期五 影响原生质体培养的因素 原生质体的活力 原生质体的起始密度 适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率常显著提高。 渗透压稳定剂 培养基营养 原生质体培养经常使用的KM-P培养基就是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS培养基为基础 改进的。 第35页，共75页，编辑于2022年，星期五 影响原生质体培养的因素 培养条件 温度，光照 植物材料和基因型 柑桔，葡萄，桃 供体细胞的生长同步性 第36页，共75页，编辑于2022年，星期五 原生质体再生过程 原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分化出完整植株的过程。 细胞壁再生 细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 植株再生 第37页，共75页，编辑于2022年，星期五 细胞壁再生是细胞分裂的先决条件 再生所需时间与植物种类和起源细胞的分化程度及生理状态有关。 再生过程：先是质膜合成细胞壁主要成分微纤维，然后在质膜表面进行聚合作用，形成多片层的结构，以后在质膜和片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。 检测新壁合成的方法 荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)和电镜技术 第38页，共75页，编辑于2022年，星期五 细胞分裂 植株再生 愈伤组织或胚状体形成 第39页，共75页，编辑于2022年