磷酸化蛋白之检测操作细节和注意事项.pdfVIP

磷酸化蛋白之western blot 检测操作细节和注意事项 1. 一定要在lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂（配方见后页），还要加入一定量的磷酸酶抑制 剂，否则即使band 压出来也会很浅，结果也不 。 2. 加一抗后最好4 度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量 的极少部分。4 度也可使一抗重复使用多次（站长注：可加入防腐剂，如叠氮钠，ProclinTM 等，保存时间更长）。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1 小时即可。 3. 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，Cell signaling 公司 做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs 磷酸化抗体 4. 最好根据厂商的protocol 来操作实验，这是实验成功的保证。如Cell signaling 会建议用 含5%BSA 的TBST 稀释phospho-p38 等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk 的TBST 。 5. 抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。 6. 研究 一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完phospho-p 38 抗体后，我会把相同的membrane