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RT-PCR 是将 RNA 的反转录（RT）和cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 首先经反转录酶的作用从 RNA 合成 cDNA，再以cDNA 为模板，扩增合成目的片段。 RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中 RNA 病毒的 含量和直接克隆特定基因的 cDNA 序列。作为模板的RNA 可以是总 RNA、mRNA 或体外转 录的 RNA 产物。。RT-PCR 用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来 检测基因表达差异或不必构建 cDNA 文库克隆 cDNA。RT-PCR 比其他包括Northern 印迹、 RNase 保护分析、原位杂交及 S1 核酸酶分析在内的 RNA 分析技术，更灵敏，更易于操 作。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物 （GSP） 起始。RT-PCR 可以一步法或两步法的形式进行。在两步法 RT-PCR 中，每一步都在最佳 条件下进行。cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出 1/10 的反应产物进行 PCR。在一步法 RT-PCR 中，逆转录和 PCR 在同时为逆转录和 PCR 优化的条件下，在一 只管中顺次进行。 逆转录酶 （reverse transcriptase）是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的DNA 聚合酶， 至少具有以下三种活性： 1、 依赖 RNA 的DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链 2、 Rnase 水解活性：水解 RNA 杂合体中的 RNA； 3、 依赖 DNA 的DNA 聚合酶活性：以第一条 DNA 链为模板合成互补的双链 cDNA. 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、 Oligo dT 及 基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞 mRNA，三种都可。 RT-PCR 实验有三步：抽提 RNA，RT，PCR。 试验前注意： 1. 做 RT 前必需测 RNA 浓度，逆转录体系对 RNA 量还是有一些要求，常用 500ng 或 1ug 2. RT 按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR 如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的 cDNA 存在，不是单改变 Mg2+浓度、退火温度能解决的。 引物合成 1、 内参照： GAPDH 正义：5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′ 反义：5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′ β-actin 正义：5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′ 反义：5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′ 2、 par-4: 正义：5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′ 反义：5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′ 、 退火温度计算 （A+T）+4 （G+C） 正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃） 4、 引物各合成 5 OD，每 OD 一瓶分装好 5、 引物稀释： 加 DEPC 水量为（μl）= ? nmol / OD × 管上所标OD 数×100 稀释为 10p mo / μl 浓度的引物溶液 注意事项： 1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴。 2、Rt 时，先打开 PCR 预热 30 分钟。 3、RNA 抽提前，打开离心机预冷。 4、在所有 RNA 实验中，最关键的因素是分离得到全长的 RNA。而实验失败的主要原因 是核糖核酸酶（RNA 酶）的污染。在实验中，一方面要严格控制外源性 RNA 酶的污染； 另一方面要最大限度地抑制内源性的 RNA 酶。RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮 沸、高压灭菌等。 、做 RT 前必需测 RNA 浓度，逆转录体系对 RNA 量还是有一些要求，常用 500ng 或 1ug。 6、RT 按要求做，一般不会出太大问题。? 7、PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的 cDNA 存在， 不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 8、注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人：氯仿、溴化乙锭（EB）、酚、异硫氰酸 胍、紫外线等