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实验一克隆载体重组子的抽提（重组质粒的提取、电泳鉴定及酶切鉴定）; 一、实验目的;1）碱裂解提取质粒原理： 主要利用宿主染色体DNA与质粒DNA之间的结构和大小的差异进行分离提取的。;二、实验原理;二、实验原理;3）限制性核酸内切酶: 是一类能够识别双链DNA分子内部的特异序列，并在识别位点或其周围产生切割作用的核酸水解酶，它存在于细菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统即保护自身DNA，限制外源DNA。①4-6碱基对，具有回纹结构的DNA片段；②水解DNA分子的磷酸二酯键③切割方式有两种：黏性末端和平末端 ④切4碱基，平均256bp出现一次切点，切6-8碱基时，每隔4-65kb出现一次切点;三、实验步骤;三、实验步骤;三、实验步骤;四、注意事项;实验二目的基因的回收、连接反应（酶切体系的电泳鉴定、回收、纯化、与载体连接）; 一、实验目的;二、实验原理; 二、 实验原理 2）T4DNA连接酶: DNA连接酶是一种封闭DNA链上的缺口的酶，借助于ATP或NAD+水解提供的能量，催化DNA的3’-OH与5’的磷酸基团生成磷酸二酯健。 T4DNA连接酶则连接双链DNA分子的粘性末端或平端。; 二、 实验原理 3）TA克隆;利用Taq酶在延伸过程中会在DNA的末端加A的特性，使PCR扩增产物和带T尾的载体在连接酶的作用下连接起来。;三、实验步骤;三、实验步骤;三、实验步骤;四、注意事项;实验三感受态细胞的制备、转化、培养; 一、实验目的;二、实验原理;2）转化子蓝白斑筛选的原理: 使用的载体带有大肠杆菌的DNA短区段，含有?-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息，这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读框，宿主细胞携带编码?-半乳糖苷酶C端部分序列，虽然宿主和质粒的片段各自都没有酶活性，但能融为一体，形成具有活性的酶蛋白质- ?-半乳糖苷酶，这种互补现象叫?互补，在生色物质X-gal存在下形成蓝色菌落，但在外源基因插入到多克隆位点后，破坏了质粒载体?-半乳糖苷基因读框，不能编码?-半乳糖苷酶，就形成白色菌落。;三、实验步骤;三、实验步骤;四、注意事项;实验四 pET-28a-SOD表达重组质粒的鉴定（重组质粒的提取、酶切及电泳鉴定）; 一、实验目的;1）碱裂解提取质粒原理： 主要利用宿主染色体DNA与质粒DNA之间的结构和大小的差异进行分离提取的。;二、实验原理;二、实验原理;3）限制性核酸内切酶: 是一类能够识别双链DNA分子内部的特异序列，并在识别位点或其周围产生切割作用的核酸水解酶，它存在于细菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统即保护自身DNA，限制外源DNA。①4-6碱基对，具有回纹结构的DNA片段；②水解DNA分子的磷酸二酯键③切割方式有两种：黏性末端和平末端 ④切4碱基，平均256bp出现一次切点，切6-8碱基时，每隔4-65kb出现一次切点;实验步骤PET-28a-Mn-SOD表达重组质粒的鉴定;流 程 图;三、实验步骤;三、实验步骤;三、实验步骤;四、注意事项;实验四(续) pET-28a-SOD表达重组质粒的鉴定（重组质粒的提取、酶切及电泳鉴定）;1、菌落PCR扩增目的片段初步鉴定表达转化子的正确 2、电泳鉴定目的条带的存在否？ 3、验证正确后用于诱导表达目的蛋白;实验六 重组蛋白的诱导; 一、实验目的;二、实验原理;;;三、实验方法;;参考内容;蛋白样品的电泳检测（SDS） 1）用洗衣粉轻轻擦洗玻璃板，两面都擦洗过后用自来水冲，再用去离子水冲洗干净后晾干备用。 2）灌胶与上样 。将玻璃板对齐后放入制胶板中卡紧，加入去离子水试漏，若不漏将水倒干净。 3）配12％的分离胶，加入TEMED后立即摇匀，马上注入两玻璃板中。灌胶时，可用1 ml微量加样器沿玻璃一侧缓缓倾注以防气泡产生，待胶面升到离玻璃板口2cm-3cm时即可。 4）然后胶上加一层水赶走气泡，且起到封闭的作用，水封后胶凝得更快并且胶面更平（灌胶时开始可以动作快一些，胶面快到所需高度时放慢速度。加水封胶面时要慢，否则胶会被冲变型而且会使水混入胶内改变胶的浓度）。 ;蛋白样品的电泳检测（SDS） 5）放置约50 min左右，当水和胶之间有一条折射线时，或者灌胶剩下的胶液已经凝固了，说明胶已凝固完好。这时轻轻倾斜胶板倒去上面的水样。 6）按上述方法配5％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀，迅速灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，迅速将梳子水平