天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞凋亡及baxbcl2基因表达的影响.docVIP

天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞凋亡及baxbcl2基因表达的影响 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞凋亡及baxbcl2基因表达的影响 1 1材料和方法 1 (40μg/ml); (80μg/ml) 4 文2：天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞凋亡及baxbcl2基因表达的影响医学论文 5 1材料和方法 5 (40μg/ml); (80μg/ml) 8 参考文摘引言： 9 原创性声明（模板） 10 文章致谢（模板） 10 正文 天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞凋亡及baxbcl2基因表达的影响 文1：天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞凋亡及baxbcl2基因表达的影响 1材料和方法 材料 （FBS）购自美国GIBCObrL公司，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）为Simga公司产品，蛋白酶K（Proteinase K）为Merck 公司产品，噻唑蓝(MTT)购自Amresco公司。一抗bcl2、bax鼠抗人单克隆抗体、βactin羊抗鼠单克隆抗体、二抗HRP标记的羊抗鼠IgG及兔抗羊IgG购于Santa Cruz Biotechnology公司，TCS购自上海金山制药厂。 及设备凝胶成像仪Thermal imaging system FTI500为Pharmacia Biotech产品， 电转移槽为BioRad公司产品，STORM (Phospher Imager System)购自Dynamic molecular公司。 方法 胞培养人宫颈癌HeLa细胞为本室传代保存，培养于5% ＣＯ2、37℃湿化孵箱中。培养基MEM含10% FBS，Ｕ/Ｌ青霉素， Ｕ/Ｌ链霉素， 取对数生长期细胞待用。 作用取对数生长期的HeLa细胞接种于96孔细胞培养板中(细胞数为每孔2×104个)，12h后加入不同浓度的TCS，每个浓度设6个平行孔，继续培养24、48、72h，每孔加入5μg/ml MTT 溶液20μl继续培养4h后加入200μl DMSO溶解，测定570nm处光吸收值，计算细胞生长抑制率。 察将处于指数生长期的HeLa细胞以不同浓度的TCS处理后，倒置显微镜下观察HeLa细胞的形态改变。 收集经TCS作用的细胞，以含% FBS的PBS清洗后加入75%的冰冷乙醇固定， 在10000min条件下离心5min，去乙醇，以PBS洗涤2次，弃上清；用 PBS重新悬浮，然后加入等体积的细胞裂解缓冲液(含1％ NP40，50mmol/L TrisHCl，40mmol/L EDTA，pH值)室温作用5min，离心后加入RNase(终浓度30μg/ml)置37℃水浴中消化30min，离心后再加人1ml PI(终浓度50μg/ml)避光染色30min，以300目尼龙网滤过，上流式细胞仪检测，Multicycles软件分析结果。 Blot检测凋亡相关蛋白bax及bcl2离心收获细胞，用预冷的PBS漂洗2遍，加入适量的细胞裂解液（临用前加入各种蛋白酶抑制剂）置冰上30min后，以13000min于4℃离心20min，调整蛋白含量， 加入等量2×SDSPAGE加样缓冲液，置95℃~100℃沸水中变性5min，行SDSPAGE垂直电泳， 电转PVDF膜，加50g/L脱脂奶粉于4℃冷库封闭过夜（或37℃封闭1h）， PBST洗膜后，分别加一抗bcl2、bax鼠抗人单克隆抗体、βactin羊抗鼠单克隆抗体(均为1∶1000稀释)37℃孵育1h，PBST洗膜；加HRP标记羊抗鼠IgG及兔抗羊IgG二抗，37℃孵育1h，PBST洗膜，等量的ECL反应液A和B混合后加至膜上1min，最后Χ片显影。 据以±s表示， 用t检验分析差异显著性， 采用Peaon相关分析进行相关检验，运用统计软件分析数据。 2结果 2．1TCS对HeLa细胞的生长抑制作用对照组HeLa细胞体外生长活跃， 实验组分别经20、40、80μg/ml TCS处理24、48、72h后，细胞生长均不同程度地受到抑制，呈时间-浓度依赖性， 按公式计算相对抑制率。相对抑制率 (%)=(1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%，结果有统计学差异（P 2．3流式细胞仪检测（PI染色法）凋亡细胞在流式细胞仪直方图上出现特征性的亚二倍体峰（subG1 peak），对照组细胞的自然凋亡率为(±)%，用不同药物浓度的TCS（20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml）处理HeLa细胞48h后，可出现明显的凋亡峰，凋亡率分别为（±)%、(±)%和(±)%，与对照组相比较有统计学差异(P 2．4凋亡相关基因bax及