植物和动物组织样本的处理方法、动物和植物组织切片厚度、FAA固定液和蔗糖-PBS溶液（3%）配制方法.docxVIP

（资料性）植物和动物组织样本的处理方法 植物组织样本的处理方法 植物组织样本固定处理 植物组织样本固定处理步骤如下： 操作人员提前准备好大小合适的容器，配制2次使用量的卡诺氏固定液（乙醇：冰醋酸=3:1），置于冰上或在-20℃的温度下预冷； 固定液体积不应超过容器容积的四分之三。 配制2次使用量的蔗糖-PBS缓冲液（3%），配制方法见附录C.2； 使用酒精对工具进行消毒并擦干，剪取植物材料，迅速放入预冷的卡诺氏固定液中，置于冰上或-20℃温度下固定1小时； 去净固定液，加入新鲜的预冷过的卡诺氏固定液中，置于冰上或-20℃温度下固定1小时； 滤去固定液，加入预冷的蔗糖-PBS溶液（3%），冰上放置1小时； 滤去溶液后，重新加入新的预冷蔗糖-PBS溶液（3%），在4℃的温度下放置过夜； 准备包埋盒并进行信息标记，加入OCT后置于冰上预冷； 滤去液体后，同镊子轻夹出样本，吸干表面液体后将样本剪切成合适包埋的尺寸，放入包埋盒中； 固定后的植物样本非常绵软，在夹出及修剪尺寸时要注意力度。 调整样本方向，将样本横切面垂直于包埋盒一侧的侧壁，使横切面贴在侧壁上方便后续切片； 将装有样本的包埋盒水平放置于小冰盒中，并将其水平放置于真空抽滤的干燥器，真空抽滤5分钟（-0.1Mpa）； 将包埋盒水平放置于有盖容器中，盖上盖子于4℃的温度下放置过夜后即可进行包埋，包埋操作程序见5.2。 植物组织样本直接包埋前处理 植物组织样本包埋前处理步骤如下： 使用酒精对工具进行消毒并擦干； 取植物样本，用剪刀剪下测试部位，并将样本剪切至便于包埋的尺寸； 以叶片为例，可将一片叶子沿垂直于主叶脉方向剪成宽度约0.5 cm的小条，尽量控制叶片宽度短于包埋盒长度，若叶片过大可按需要修剪。 用镊子夹起剪切好的植物样本，快速放入在冰上预冷的OCT包埋盒中，并调整样本方向； 以叶片为例，将叶片条竖起，横切面正对包埋盒的底面，将叶片条沿着包埋盒的一遍竖直排列在OCT中，用镊子将叶片条轻轻往下压，使叶片横切面尽量贴到包埋盒底部，尽量保持叶片条垂直于包埋盒底部，不倾斜；以花序为例，用镊子将花序轻轻下压，使花序以侧面方向贴到包埋盒底面，并用镊子轻压每朵消化，使其尽量贴到包埋盒底面。 将装有植物样本的包埋盒水平放置到冰盒中，再将冰盒水平放置于真空抽滤的干燥器中真空抽滤5分钟（-0.1Mpa）； 抽滤后，材料位置会发生一定变化，再次用镊子轻压样本，使样本贴在包埋盒底面上，以方便后续切片； 参照5.2进行包埋处理。 动物组织样本的处理方法 动物组织样本处理（灌流取样法） 动物组织样本处理步骤如下： 根据动物类型选择合适的麻醉剂，对实验动物进行深度麻醉，应确保对实验动物的四肢或肌肉进行动作时，无任何疼痛或应激反应； 将动物头部固定在立体定位仪上，沿胸骨柄剪开胸腔，剪开心包膜，暴露心脏。与心尖成30°～45°夹角剪开左心室，随即剪开右心耳，将灌注针头从左心室插入主动脉，固定针头； 灌注常温通氧的人工脑脊液（ACSF，0.6L/kg），并记录开始灌注时间； 常温ACSF灌注结束后，开始灌注提前预冷通氧的ACSF，记录开始灌注时间； 预冷ACSF灌注10分钟后，观察灌注效果，准备取样本组织； 样本组织获取后需立即进行包埋，处理过程应尽快完成，确保组织的新鲜度。 以脑组织为例，在记录灌注时间时，同时剪去动物头部皮肤准备开颅。ACSF灌注10分钟后，揭开硬脑膜观察灌注效果，准备取脑组织。取脑组织时，借助立体定位仪和显微操作器将脑组织沿正中矢状面分为左右半脑。先取下右半脑进行矢状面包埋。随后，在左半脑AP方向中点的位置，沿冠状面将左半脑一分为二，并立即进行左半脑的冠状面包埋。 动物组织样本直接包埋前处理 动物组织样本包埋前处理步骤如下： 针对不同组织可采用不同方式获取新鲜组织样本； 将新鲜组织放入清洗液中清洗2～3次，去除表面杂质。清洗后需用无菌无纺布/无菌无尘纸擦干表面液体（如需要）； 新鲜组织离体后需使用无菌无纺布/无菌无尘纸将组织表面的血迹或黏液等液体擦拭干净； 如浸泡或清洗组织，需吸干组织表面液体，避免在组织表面形成冰块影响后续包埋切片。 使用酒精对工具进行消毒并擦干； 根据组织大小提前准备好合适的包埋盒，将样本剪切至便于包埋的尺寸； 参照5.2进行包埋。  （资料性）动物和植物组织切片厚度 动物和植物组织切片厚度 动物和植物组织切片厚度见表B.1。 表B.1 动物和植物组织样本切片厚度 样本类型 组织 切片厚度 动物 脑 10μm 心脏 10μm 肾脏 10μm 肺 10μm 胃 10μm 大肠 10μm 小肠 10μm 脾脏 10μm 卵巢 10μm 睾丸 10μm 眼睛 10μm 甲状腺 10μm 股四头肌 10μm 乳房 10μm～20μm 植物 叶芽 10μm 叶、根、茎