川芎简单序列重复间区多态性和扩增片段长度多态性分子标记技术多态性比较研究.doc

川芎简单序列重复间区多态性和扩增片段长度多态性分子标记技术多态性比较研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：川芎简单序列重复间区多态性和扩增片段长度多态性分子标记技术多态性比较研究 2 1 材料 3 2 方法 3 3 结果 5 4 讨论 6 文2：川芎简单序列重复间区多态性和扩增片段长度多态性分子标记技术多态性比较研究 7 1 材料 8 2 方法 8 3 结果 10 4 讨论 11 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 14 正文 川芎简单序列重复间区多态性和扩增片段长度多态性分子标记技术多态性比较研究 文1：川芎简单序列重复间区多态性和扩增片段长度多态性分子标记技术多态性比较研究 川芎Ligusticum chuanxiong Hort.为伞形科藁本属的多年生植物，是著名传统中药材。以根茎供药用，具有活血行气，祛风止痛的功效，用于月经不调、经闭痛经、癥瘕腹痛、胸肋刺痛、头痛、风湿痹痛等［1］。在中国普遍分布在四川、江西、云南、吉林、甘肃、贵州、江苏等省。四川为川芎道地产区［2］，川芎已有一千五百多年栽种的历史。长期的自然选择和人工选择使不同产地的川芎从外部形态到有效成分的组成及含量上均存在一定差异［3］。但目前有关川芎的研究大多集中在药用成分分析，药理作用等方面［3，4］，遗传多样性研究几乎是空白。因此，寻找高效率鉴定川芎不同种质资源的有效分子标记技术方法具有重要意义。 简单序列重复间区多态性 (ISSR)和 扩增片段长度多态性(AFL P)这两种分子标记方法已在遗传群体结构分析、亲缘关系分析以及基因图谱构建等方面得到了应用［5～8］。ISSR与AFLP标记均具有无需预先知道受试基因组DNA序列， DNA用量少，灵敏度高，对反应条件不敏感，重复性好，能提供丰富的关于基因组的信息等优点， 一般而言， AFLP具有更高的灵敏度，能检测出更高的遗传多样性，但所需仪器和药品价格昂贵，实验成本高，检测过程繁琐；ISSR分子标记技术具有操作简单、实验成本低的优点，但灵敏度不高。选择合适的分子标记对能否客观反映研究对象的状况具有重要的影响［9］ 。本研究对ISSR和AFLP 两种分子标记方法进行了比较研究， 旨在寻找适合川芎的高效分子标记， 以期为川芎的真伪辨别、遗传育种及种质资源的保护和合理利用提供科学依据。 1 材料 30个川芎样品采自四川崇州(编号1～10)、都江堰(编号11～20)、新都(编号21～30)，每样株间隔距离至少5 m以上，每株采集的叶片迅速装入自封袋中用硅胶干燥保存，并尽快进行总基因组DNA的提取。 2 方法 基因组DNA的提取采用CTAB，并进行改良［10］。1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度仪测定DNA浓度。 ISSR扩增及检测ISSR引物(UBC set ) 由加拿大哥伦比亚大学提供。从100条引物筛选出扩增条带清晰、重复性较好的引物用于PCR扩增。ISSR反应体系为 25 μl，包括2 μl DNA模板( 25 ng/μl ) 、 μl引物( 1 mmol/L)、5 μl dNTP (1 mmol/L)、2 μl 10 ×PCR buffer，1 U rTaq DNA聚合酶和 μl ddH2O。dNTP，rTaq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司;扩增反应在PTC100TM(Programmable Thermal Con2troller， MJ Research Inc ，美国) PCR扩增仪上进行; PCR反应程序为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s，48～52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共计45个循环; 72 ℃延伸7 min; 4 ℃ 10 min终止反应;扩增反应结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE) ，电压80 V，电泳时间30 min，然后用EB染色，凝胶成像系统照相，观察扩增结果。 AFLP扩增及检测接头与引物按照文献［11］提供的序列，由北京赛百盛公司合成。从选择性引物中筛选出条带清晰、反应稳定的引物组合进行AFLP分析; AFLP反应参照文献［12］进行。取400 ng总DNA用EcoRⅠ (Biolabs)和MseⅠ(Biolabs)双酶切，酶切产物用T4 - 连接酶( TaKaRa)与接头连接;然后用无选择性碱基的引物进行预扩增，预扩增程序为:94 ℃变性2 min， 94 ℃变性30 s， 56 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min， 30个循环后， 72 ℃延伸5 min， PCR反应结束后，置4 ℃保存。取10 μl预扩增产物×TE稀释10倍，作为选择性扩增反应模板;选择性扩