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肝肾综合征大鼠肾组织葡萄糖调节蛋白与Toll样受体4的表达 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：肝肾综合征大鼠肾组织葡萄糖调节蛋白与Toll样受体4的表达 1 1 材料和方法 2 1．2 方法 2 2 结果 4 3 讨论 6 文2：肝肾综合征大鼠肾组织葡萄糖调节蛋白与Toll样受体4的表达临床医学论文 7 1 材料和方法 8 1．2 方法 8 2 结果 10 3 讨论 12 参考文摘引言： 14 原创性声明（模板） 15 文章致谢（模板） 16 正文 肝肾综合征大鼠肾组织葡萄糖调节蛋白与Toll样受体4的表达 文1：肝肾综合征大鼠肾组织葡萄糖调节蛋白与Toll样受体4的表达 肝肾综合征是肝硬化失代偿期的常见并发症， 炎性损伤是其发生的主要机制之一［1］。近来研究认为， 内质网应激蛋白不仅是分子伴侣， 而且可作为内源性“危险分子”被Toll样受体（Tolllike receptor， TLR）识别， 而参与炎性应答［2］。本研究中， 我们从TLR4表达变化来探讨内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白（glucoseregulated protein， GRP）78、 94在肝肾综合征中的作用。 1 材料和方法 材料 SD大鼠雌雄不限(体质量220～250 g， 给予标准饮食、 22℃～24℃、 12 h白天/黑夜循环、 湿度55％～60％的动物房饲养)， 购于浙江大学医学实验动物中心。TRIzol购于Invitrogen公司; RTPCR试剂盒购于Promega公司; TritonX100蛋白裂解液购于Sigma公司; 山羊抗大鼠GRP78/94、 TLR4、 三磷酸甘油醛脱氢酶（GADPH）单克隆抗体（mAb）及过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG 抗体购于Santa Cruz Biotechnology公司; 大鼠TNFα试剂盒购于深圳晶美公司。其余试剂均购于上海生工公司。βactin、 GRP78/94、 TLR4 mRNA引物由上 海生工公司合成。 1．2 方法 引物设计 TLR4引物（600 bp， NM019178）: 上游5′CCA AGA ACC TAG ATC TGA GC3′; 下游5′GGA CAT GTA AAC CAG TCA TG3′。 GRP78引物（489 bp， U16277）: 上游5′GGC GGA TCG TGC CTC TCA TT3′; 下游5′GAC CAG TCG CTC AGC AGT CA3′。GRP94引物（460 bp， BC011439）: 上游5′CCA TGG CTT ATA TCC ACT TC3′; 下游5′GTA ATG TCA GTT GAA TGG TG3′。βactin引物（270 bp， NM031144）: 上游5′GTA GCC ATC CAG GCT GTG TT3′; 下游5′GAA GTC TAG GGC AAC ATA GC3′ 大鼠肝肾综合征模型构建 SD大鼠饲养1周后， 随机分为2组。实验组（BDL组）用胆总管结扎法诱导肝硬化［1］: 戊巴比妥腹腔麻醉SD 大鼠， 开腹暴露胆总管， 用丝线在胆总管远、 近端结扎， 于两结扎中间剪断胆总管， 关腹。假手术组（Sham组）仅开腹， 暴露胆总管但不剪断， 再关腹。两组分别在术后1、 2、 4、 6周各取6只大鼠称体质量， 股静脉采血测血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）、 总胆红素（TBI）、 尿素 氮（BUN）、 肌酐（CRE）及TNFα含量; 然后用戊巴比妥腹腔麻醉后处死取肝、 肾并称体质量。200 mg肾组织置于-70℃液氮保存备用; 肝、 肾组织各500 mg以100 g/L甲醛固定， 石蜡包埋、 切片， 苏木素伊红（HE）染色。由两位病理医师双盲评价肝、 肾组织病理。 检测方法 ALT、 TBI、 BUN、 CRE于TMS1024全自动生化仪检测。 ELISA检测血浆TNFα的含量 按说明书进行操作， 检测样本A450值， 用TNFα标准液绘制曲线， 从曲线中得出各样本TNFα含量。 总RNA抽提和RTPCR 肝组织匀浆、 TRIzol抽提RNA， 禽类成髓纤维病毒逆转录酶（AMV酶）42℃逆转录。25 μL PCR反应体系， βactin为内参照。扩增参数: 94℃ 5 min; 94℃ 40 s， 56℃(GRP78)/50℃(GRP94)/52℃(TLR4) 40 s， 72℃ 90 s， 35循环; 72℃ 5 min。DL 2 000 marker确定