第十三单元综合性实验.pptVIP

实验一 酶联免疫吸附实验检测 伤寒O抗体方法的建立 （综合性实验） 第一页，共三十六页。 实验原理 检测伤寒O抗体在伤寒菌感染的诊断中具有重要意义，采用肥达反应可对抗体进行半定量检测；若采用新一代的免疫检测技术建立对伤寒O抗体准确定量检测的法，则可提高临床诊断效果。以伤寒O抗原免疫动物，制备出抗伤寒O的抗体，将后者纯化抗体与酶连接制备成酶标抗体;以伤寒O抗原包被酶标板，制备伤寒酶标抗体为竞争抗体，以竞争法检测伤寒抗体酶联免疫检技术。 第二页，共三十六页。 1. 伤寒沙门菌菌体“O”抗原（免疫用） 2. 伤寒沙门菌可溶性菌体“O”抗原（包备用） 3. 饱和硫酸铵溶液 4. 酶标用洗涤液 5. 酶标用稀释液 6. 酶标用底物液 7. 酶标用终止液 (2mol/L H2SO4 ) 8. 伤寒“O”抗原包被酶标板 9. 待检血清标本　 10.实验室标准阳性血清 11.ELISA读数仪　 实验材料 第三页，共三十六页。 制备抗伤寒O抗体和O抗原 抗体纯化 酶(HRP)标记抗体 竞争ELISA检测伤寒O抗体条件的优化 标准曲线确定 标本检测与结果判断 实验流程 第四页，共三十六页。 取伤寒沙门菌标准菌株（伤寒沙门菌O901）的典型光滑型菌落，密集划线接种于普通琼脂平板，37℃　培养24h，用无菌生理盐水洗下菌苔，移入无菌的三角烧瓶中。充分振摇，置100℃　水浴1h，杀菌及破坏H抗原。菌悬液离心，4000r/min，10min，弃上清。菌体再用无菌生理盐水洗涤，弃上清。无活菌试验合格后，用无菌生理盐水稀释成8~10亿／ml，即成伤寒沙门菌“O”菌体抗原。 实验方法 伤寒沙门菌菌体“O”抗原（免疫用） 第五页，共三十六页。 取伤寒沙门菌O901接种于普通琼脂平板，37℃　培养24h，用无菌生理盐水洗下菌苔，配成70~100亿/ml菌悬液，隔水煮沸2h，离心，3500r/min，10min，取上清即伤寒沙门菌可溶性菌体“O”抗原。 伤寒沙门菌可溶性菌体“O”抗原（包备用） 日期 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 抗原剂量（ml） 0.1 0.2 0.3 0.5 1.0 途径 多点皮内 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 表1 制备细菌免疫血清的免疫程序 第六页，共三十六页。 抗体制备 制备抗伤寒O抗体 推荐快速免疫方案供参考采用（表1）：取已制备的伤寒沙门氏菌体O抗原（１０亿／ml），免疫程序如下表。最后两次注射剂量较大，要缓慢推注。在末次免疫2天后试血，采用直接凝集法测定效价（见第二单元）。如凝集效价大于1∶1280，则可于一周后放血。效价过低，可再加强注射。 日期 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 抗原剂量（ml） 0.1 0.2 0.3 0.5 1.0 途径 多点皮内 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 表1 制备细菌免疫血清的免疫程序 第七页，共三十六页。 1份免疫血清加1份生理盐水，边搅拌边滴加2份饱和硫酸铵溶液，于4℃静置2h，2000r/min离心20 min，吸弃上清，将沉淀溶于适量生理盐水（尽量保持高蛋白浓度），放置透析袋中，多次更换生理盐水(透析液)，得初步纯化的免疫抗体。采用改良NaIO4标记法将酶与抗体的连接，其他备选的标记方法请参考单元一。 抗体的纯化与酶标记 第八页，共三十六页。 取5 mg HRP溶于0.5 ml双馏水中，加入新配制的0.06 M NaIO4水溶液0.5 ml，混匀，4 ℃ 30 min； 再加入0.16 M乙二醇水溶液（10 ml H2O+0.09 ml乙二醇）0.5 ml，室温放置30 min。 然后加入含5 mg纯化抗体的水溶液1 ml，混匀，并装入透析袋，于0.05 M pH 9.5碳酸盐缓冲液中搅拌透析6 h（或过夜），使之结合； 加入NaBH4溶液（5 mg/ml）0.2 ml，混匀，4 ℃ 2 h； 最后缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4 ℃ 30 min，离心，去上清，以0.02 M pH 7.4 PBS液溶解沉淀并4 ℃透析除盐过夜； 次日取出离心，去除沉淀，即得酶-抗体（HRP-IgG）结合物，以0.02 M pH 7.4 PBS液加至5 ml。 改良NaIO4标记法将酶 第九页，共三十六页。 ①将酶标抗体用稀释液做系列稀释，加入包被有伤寒抗原的酶标板中（50μl/孔），37℃ 30min。 ②洗涤液充分洗涤3次，甩干。 ③各孔内加底物液0.1ml，置暗处20 min。 ④各孔内加入终止液终止反应。 ⑤用酶标仪检测OD值。