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外源性DNA检测方法介绍 Introduction of exogenous DNA detection 汇报人：李爽 日期：2016年5月6日 目录 外源性DNA检测的意义 国内外残留DNA的标准规定 常用检测方法 总结 外源性DNA检测意义 重组蛋白药 抗体药 疫苗 工程菌 动物细胞株 传染性风险 致瘤性风险 生物代谢 外源性DNA 国外残留DNA标准的规定 非口服的生物制品DNA残留量为10ng每人份剂量 生物制品DNA残留量不高于100pg 大剂量制品放宽到10ng每人份剂量 对于残余 DNA的限度规定为不超过 10 ng每人份剂量，但针对个别疫苗会有不同 WHO FDA 欧洲药典 01 02 03 我国残留DNA标准的规定 产品来源 产品名称 细胞 DNA标准 国产疫苗 狂犬病疫苗 Vero 100pg/剂量 肾综合征出血热疫苗 Vero 100pg/剂量 甲型肝炎灭活疫苗 Vero 100pg/剂量 乙型脑炎疫苗 Vero 10pg/剂量 乙型肝炎疫苗 CHO 10pg/剂量 进口疫苗 小儿麻痹疫苗 Vero 10pg/剂量 狂犬病疫苗 Vero 10ng/剂量 治疗性生物制品 干扰素、G-CSF、GM-CSE、白介素等 E.coli/Yeast 10ng/剂量 EPO、单克隆抗体等 CHO 100pg/剂量 我国部分疫苗及治疗用生物制品残余DNA标准 常用检测方法 01 02 03 04 定量PCR法 荧光染料法 阈值法 分子杂交法 定量PCR法（实时荧光定量核酸扩增检测系统） 基于 PCR扩增时 ,在加入引物的同时加入特异性的荧光探针，当引物引导DNA聚合酶沿着模板序列复制合成另一条对应序列时，DNA聚合酶切断结合在目标DNA上的探针染料端，释放到反应液里的染料信号被仪器测量。通过实时监控 PCR体系中的荧光信号, 对样本中初始模板进行定量分析。 优点：时间短、特异性强、灵敏度高 缺点：成本高、设计引物、特定目标 Taqman探针法 阈值法 基于两种DNA序列非特异性蛋白 生物素标记的单链DNA结合蛋白 结合尿素酶的抗单链DNA的抗体 阈值法 膜放入含有尿素溶液的检测仪器中尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2，导致溶液pH值发生变化并被仪器记录 DNA变性成单链 单链DNA、DNA结合蛋白、DNA抗体共同形成序列非特异的复合物 通过生物素标记的膜，亲和素-生物素结合把DNA复合物固定在膜上 优点：时间短、灵敏度高 缺点：非特异性、成本高 荧光染料法 原理：荧光染料分子直接与双链DNA结合，在波长为480nm激发下产生超强荧光信号，可用荧光酶标仪在波长520nm处进行检测 优点：操作方便、时间短 缺点：不能检出单链DNA、荧光信号易受干扰 分子杂交法 INSERT TEXT 01 02 杂交 双链DNA变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下与特异性、地高辛标记的探针重新结合成为双链DNA 基本原理：双链DNA变性后吸附在固相膜上与标记好的DNA探针杂交结合，并在膜上对应位置显现斑点。 免疫检测 使用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫反应，然后与显色底物NBT/BCIP发生显色反应 分子杂交法 DNA探针是被生物素、放射性同位素、地高辛和荧光等随机掺入标记的与目的基因互补的DNA片段 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子 DIG 通过一个含有11个碳原子的空间臂与尿嘧啶核苷酸相连，形成DIG-11-dUTP，它可以通过随机引物标记，缺口平移，PCR等掺入到DNA探针中 分子杂交法 DNA模板变性之后与随机引物杂交，在klenowDNA聚合酶的作用下DIG-11-dUTP掺入新链中 随机引物法标记DNA探针 分子杂交法 总结 四种检测方法竞争分析 定量PCR法 阈值法 荧光染料法 分子杂交法 灵敏度 1pg 2pg 300pg 10pg 检测通量 高 中 高 中 检测成本 高 高 中 低 检测时间 2小时 6小时 2小时 3天 抗干扰性和稳定性 中 高 低 高 中国药典收录方法 无 无 有 有 Thank you 谢谢您的观看！