外源性DNA残留检测原理及过程PPT课件.ppt

外源性DNA残留检测原理及过程 培训资料（QC内部） 1 外源DNA残留理论 供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA的含量。 2 DNA变性过程 3 理论详解 变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation）。通常DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm低25～30℃左右时，变性后的单链DNA即可恢复双螺旋结构，因此，这一过程又叫做退火。复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。倘若DNA热变后快速冷却，则不能复性 4 理论详解 影响复性速度的因素很多，同样条件下，DNA顺序简单的分子复性很快，如polyd[T]和polyd[A]由于彼此互补识别很快，故能迅速复性。但顺序较复杂的DNA分子复性则较慢。因此通过变性速率的研究，可以了解DNA顺序的复杂性。DNA片段的大小也影响变性的速率，因为DNA片段愈大，扩散速度愈低，使DNA片段线状单链互相发现互补的机会减少。因此，在复性实验中，有时将DNA切成小片段，再进行复性。同样条件下，同一种DNA浓度愈高，复性速度也愈快。溶液的离子强度对复性速度也有影响，通常盐浓度较高时，复性速度较快。 5 理论详解 有人最早对DNA变性过程进行深入研究的。它们所获得的结果表明，在达到Tm值时，两条DNA单链分离开。如果在加热之后慢慢地冷却，则出现部分复性，即DNA的一部分回复到双螺旋结构。复性的程度取决于DNA浓度及信息含量的多少。病毒DNA（信息含量少）比哺乳动物DNA容易复性，而DNA浓度较高时，有利于复性，快速冷却使DNA仍然处于变性状态，这时自由单链成链线团结构。对这种情况，人们称之为螺旋-线团转化过程（helix-coil-transition）。快速冷却时消光系数固然有所下降，但比天然DNA的数值始终要大 6 实验过程流程图 7 DNA探针标记 1.用灭菌注射水稀释阳性DNA到62.5ug/ml，取16 μL 阳性对照DNA溶液(含DNA1ug)加Eppendorf 管。 2. 置100℃ 水浴10 分钟，然后即刻冰浴冷却。 3 .加4μL Kit 1(DIG-High Prime)到已经变性的DNA管中，混合后简单离心。 4 .置37℃ 水浴 温育过夜。 5 .置65℃温育10分钟，以终止标记反应。 8 样本的处理 1.阳性对照 ：用TE缓冲液稀释阳性DNA对照至1000ng/mL、然后依次10倍稀释成100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL。 2.阴性对照：采用TE缓冲液为阴性对照。 3.供试品、阳性对照和阴性对照加样。 注：供试品按抗体1人份剂量按700mg计，检测加样量含1/100人份剂量，即7mg。供试品可根据实际蛋白浓度，计算加样量。阳性对照和阴性均加样100ul。 9 装膜点样 1.将裁剪好的膜预先用TE缓冲液浸湿，然后把杂交膜装载于Bio-Rad 点样器上。 2 .所有阳性和阴性对照DNA、以及待检样本分别置100℃水浴10 分钟后即刻冰浴冷却。 3. 以8000rpm转速 离心 5 分钟。 4 .取上清液点样，阴性对照和阳性对照点样量100 μL，供试品为实际的计算量。DNA标准阳性对照范围从 100 ng 至 10 pg /点。 5.阳性对照梯度点为一排，供试品、阴性对照另点一排；点样完毕后，再用TE缓冲液冲洗一次，取出杂交膜用铅笔做好标记。 6.膜放到紫外灯下，紫外交联1个小时，然后将膜放入烤箱80℃烘烤2小时固定DNA。 10 杂交 1.预杂交 ：将点样的膜放入杂交液中40℃下预杂交30分钟。 2 .探针变性 ：将探针放入100℃水浴5 min，即刻放入冰盒冷却变性； 3 .将变性的DNA探针加入预热的杂交缓冲液 DIG Easy Hyb (约需3.5 mL/100 cm2 膜面积) ，充分混匀。 4 .点样膜经预杂交后，丢弃预杂交溶液，代之以探针/杂交混合物。 5 .置40℃ 温育16 小时以上。 6. 使用过的DNA探针杂交缓冲液 DIG Easy Hyb可以保存在-15～-25℃中反复使用几次,使用前在68℃加热10分钟使用。 11 洗涤 用洗涤液A洗涤2次，每次约50 mL，每次5min。 09.5.2 在65-68℃下，用洗涤液B洗涤2次，每次约50 mL，每次15min。 显色 12 显色 1.用20mL洗涤缓冲液洗涤5分钟。 2 .用封闭液20mL封闭30分钟。