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探讨定向进化转录调节基因在对漆酶异源表达的作用 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：探讨定向进化转录调节基因在对漆酶异源表达的作用 1 1、材料与方法 2 2、结果与讨论 5 3、结论与展望 7 文2：商务英语函电在对外贸易的作用 7 （二）在文本上，文本正规化 7 （三）在格式上，格式得到逐步更新 7 四、新形势下商务英语函电在对外贸易当中的作用 8 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 探讨定向进化转录调节基因在对漆酶异源表达的作用 文1：探讨定向进化转录调节基因在对漆酶异源表达的作用 漆酶(Laccase，.2)是一种含有四个铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，能够催化多种酚类和非酚类的化合物[1，2，3]，因此在造纸漂白[4，5]、染料脱色[6，7]、食品加工[8]、环境保护[9]等领域有广阔的应用前景。但是，自然界的野生菌漆酶存在酶活低、产量低、培养周期长、高温易失活等问题，导致其难以应用于工业生产。随着分子生物学和基因组学的迅猛发展，通过定向进化技术来提高漆酶表达量、催化能力、稳定性及底物特异性等;寻找合适的载体进行漆酶基因的异源表达来提高表达量，都是目前解决问题的有效方法[10，11，12] 定向进化是一种在实验室模拟达尔文进化的过程，通过对基因进行突变或重组，建立突变库以筛选到性能更好的蛋白，是一种最有前途的提高漆酶表达和性能的方法[13]。酿酒酵母因其操作简单，生产成本低，分泌表达易于纯化，能对表达蛋白进行加工、修饰等诸多优点脱颖而出，成为目前最主要的外源蛋白表达宿主之一[14]。此外，酿酒酵母因不产生毒素，安全性好，成为一种与人类生活密切相关的酵母，广泛应用于食品工业和生物医药领域[15]。作为真核生物的模式菌，酿酒酵母全序列的测定已于1996年完成，是目前了解最完全的真核生物[16]。因此，本章通过对漆酶Lcc转录调节区域进行突变，并将pYES2-Lcc突变质粒转化酿酒酵母进行异源表达，构建酿酒酵母菌株突变库，利用以ABTS为底物的酶活检测筛选方法，筛选出高酶活、高表达量的突变菌株。 1、材料与方法 菌株和质粒 大肠杆菌BL21Gold(DE3)、酿酒酵母INVSc1菌株由本实验室保存，重组载体pYES2-Lcc由本实验室构建。 酶和试剂 EasyTaqDNAPolymerase、10×EasyTaqBuffer、、基因Marker(Tra15KDNAMarker)购自TraGenBiotech公司;质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司;酵母质粒小提试剂盒、无氨基酵母氮源(YNB)购自Solarbio公司。胰蛋白胨Tryptone、酵母提取物YeastExtract购自英国OXOID公司;琼脂糖Agar购自Sigma公司;2，2-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)购自Coolaber公司;其它试剂均为国产分析纯。 培养基 (1)YPAD培养基:1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖，%硫酸腺嘌呤，121℃灭菌15min。 (2)SC-U培养基:%无氨基酵母氮源，2%碳源(葡萄糖或棉子糖)，%(腺嘌呤，精氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，赖氨酸，苏氨酸，色氨酸)，%(天冬氨酸，组氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，酪氨酸，缬氨酸)，固体培养基添加2%Agar，121℃灭菌20min。 (3)HC预培养基:10%10×YNB，10%10×HCdropoutsolution，20%200g/Lgalactose，10%1mol/LpH值缓冲液，50%去离子水。 (4)HC表达培养基:10%10×YNB，10%10×HCdropoutsolution，20%200g/Lgalactose，10%1mol/LpH值缓冲液，%/L，%去离子水，过滤除菌。 转录调节序列突变库构建 将实验室保藏的大肠杆菌BL21/pYES2-Lcc划线于LB(Amp)固体平板，挑取单克隆接种于LB(Amp)液体培养基，并于37℃、200min的恒温摇床中过夜培养。利用质粒小提试剂盒提取pYES2-Lcc质粒，作为易错PCR的模板DNA，以fwlcc-调节区域为上游引物，其碱基序列为5-GTGGAAGCGGTATTCGCAATG-3，rev-lcc-调节区域为下游引物，其碱基序列为5-GAGCTCGGTACCAAGCTTAATATTCC-3。反应体系:TemplateDNA(50ng/μL)2μL，10μMForwardPrimer2μL，10μMReveePrimer2μL，10×EasyTaqBuffer10μL，μL，EasyTaqDNAPolym