单克隆抗体实用技术手册介绍.docx

单克隆抗体实用技术 目录 TOC \o 1-3 \h \u 11187 一、抗体技术概述 2 19028 二、单克隆抗体技术的历史 3 4581 三、单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 4 4581 四、抗原的制备 4 21123 五、动物免疫 20 1443 六、免疫失败的可能原因及应采取的措施 22 7301 七、多克隆抗体技术及其制备 22 14794 八、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 32 12214 九、脾细胞制备 35 30664 十、细胞融合 36 5576 十一、阳性细胞株的筛选、检测 39 5092 十二、杂交瘤的克隆化 42 835 十三、杂交瘤细胞的保存与复苏 45 5135 十四、杂交瘤细胞的大量繁殖（腹水的制备） 47 22866 十五、单克隆抗体的提纯 48 32557 十五、单克隆抗体的鉴定 59 8952 十六、单克隆抗体的非特异性结合阻断 60 一、抗体技术概述 当前，免疫学技术正沿着基础研究－应用研究－高技术开发研究3条主线在开展，三者互相促进，推动着技术平台的发展；同时它不断向生物学和医学各个学科渗透，推动现代医学的发展。抗体技术在免疫学中占着重要的地位。杂交瘤技术的建立和细胞因子对免疫细胞发育、分化影响的发现，基因工程技术的发展，使实验室的研究直接转向生物高技术产品的开发，如重组细胞因子、单克隆抗体及其相应的试剂盒、基因工程抗体和疫苗等已经或正在投入临床使用，特别是抗体药物以其对人体无毒无副作用、完全天然和高度特异性的疗效，越来越显示其优势，并创造出巨大的社会效益和经济效益。随着人类全基因组的破译，相信抗体技术将会有更广阔应用前景。抗体的类型主要有：1．多克隆抗体 主要是将有效抗原注入人体或动物，由人或动物体内的B细胞产生抗体。由此产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称之为多克隆抗体。此技术经过长期实践已经发展的相当成熟，在免疫学诊断中的应用也相当广泛。2、单克隆抗体 杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。脾淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长（选择原理见后），小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓“永生”性。在选择培养基的作用下，只有Ｂ细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。单克隆抗体的理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制，并且来源容易，所以一问世便受到欢迎和重视。在医学领域中，McAb在诊断疾病、判断预后、防治疾病以及疾病机制研究等方面起着巨大的促进作用。3、基因工程抗体 基因工程抗体即将抗体的基因按不同需要进行加工、改造和重新装配，然后导入适当的受体细胞中进行表达的抗体分子。与单克隆抗体相比，基因工程抗体具有如下优点：通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；根据治疗的需要，制备新型抗体；可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种 二、单克隆抗体技术的历史 当两个细胞紧密地接触的时候，其细胞膜可能融合在一起，而融合的细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体（heterokaryon），在适当的条件下，它们可以融合在一起，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。多年来，在进行体细胞融合过程中，常常发现杂交细胞染色体丢失，只保留亲代细胞的某一种特性。 1975年，Kohler和Milstein应用小鼠骨髓瘤细胞和绵羊细胞致敏的小鼠脾细胞融合，得到的一部分融合杂交细胞既能继续生长，又能分泌抗羊红细胞抗体，将这种杂交细胞系统称为杂交瘤，应用这种方法可制备单一抗原决定簇的单克隆抗体。 事实上在此之前，1970年Sinkovics等人已经报导过产生特异性病毒抗体的淋巴细胞和由病毒引起的肿瘤细胞可以自然地在体内形成杂交瘤分泌特异性抗体。1973年Schwaber与Coken首次报导了鼠－人杂交瘤的成功。1974年Bloom与Nakamura首次应用人的B细胞与人的骨髓瘤细胞融合产生淋巴因子。以后于1980年Luben与Molle证明，在体外培养10天的小鼠胸腺细胞能够产生淋巴因子，并能代替在体外培养中产生初次免疫（primary immunization，也称原发性免疫）反应所需要的免疫T细胞。他们应用这种胸腺细胞培养液（称为条件培养液）加到小鼠脾细胞培养物中，并加入抗原（淋巴因子－破骨细胞激活因子