分子生物学研究法上.pptVIP

2022/5/23 * 5?RACE 在反转录酶的作用下,以已知基因片段内部特异性引物(GPS1)启始cDNA第一条链的合成 RNase降解模板mRNA,纯化cDNA第一条链。 用末端转移酶在cDNA链3?端加dC,形成寡聚(dC)尾巴。 以连有寡聚(dG)的锚定引物(AP)和基因片段内部特异引物(GPS2)进行PCR扩增,以期得到目的基因5?端片段。 2022/5/23 * 3?RACE 在反转录酶的作用下,以连有可以和polyA配对的寡聚(dT)的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。 RNaseH降解模板mRNA。 用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增,以期得到目的基因3?端片段。 2022/5/23 * 5.4.2 应用cDNA差示分析法克隆基因 cDNA差示分析法(RAD)充分发挥了PCR能以指数形式扩增双链DNA模板,仅以线形形式扩增单链模板的特性,通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法,特异性扩增目的基因片断。 试验材料(Tester T)和探针材料(Driver D)在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理,形成平均长度256bp的代表群,保证绝大部分遗传信息能被PCR扩增。 每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸,94℃变性这两个参数共20个PCR循环,PCR产物的特异性和所得探针的纯度非常高。 2022/5/23 * 2022/5/23 * 5.4.3 Gateway大规模克隆技术 Gateway基因大规模克隆法利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组,实现不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移,为大规模克隆基因组注释的可读框提供了保障。 Gateway克隆技术包括TOBO反应和LR反应。 TOBO反应将目的基因连入Entry载体(见P194图5-25a)。 LR反应将目的基因片段从Entry载体重组到表达载体(见P194图5-25b)。 2022/5/23 * 5.4.4 基因的图位克隆法 基因的图位克隆法是分离未知性状目的基因的一种好方法。从理论上说,所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。 首先,通过构建遗传连锁图,将目的基因定位到某个染色体的特定位点,并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。 其次,利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作探针,通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。 再根据基因功能互作原理鉴定目的基因。 2022/5/23 * 染色体步移: 利用已知的基因或分子标记来筛选大片段的DNA文库获得阳性克隆,如此得到的阳性克隆是“一步克隆”。 利用获得的克隆作探针对文库进行第二次杂交,得到与探针具有重复序列的阳性克隆称为“二次克隆”。 如此反复即可取到需要的克隆,获得目的基因。 2022/5/23 * 5.5 蛋白质与蛋白质组学技术 蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的。 蛋白质组学研究成功与否,很大程度上取决于其技术方法水平的高低。 蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。 蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析,往往要同时处理成千上万种蛋白质。 发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。 2022/5/23 * 5.5.1 双向电泳技术 双向电泳(2-DE)技术是分离大量混合蛋白质的最有效方法。 蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心。 双向电泳包括等电聚焦(IEF)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS)两种电泳技术。 第一向等电聚焦电泳 不同等电点蛋白会聚集在介质的不同区域。 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 不同分子量的蛋白质分离。 2022/5/23 * pH3 等电聚焦电泳 pH10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 2022/5/23 * 5.5.2 荧光差异显示双向电泳技术 荧光差异显示双向电泳技术(2D-DIGE)主要利用蛋白质的等电点和分子量的差异来分离蛋白质混合物,同时应用荧光染料的灵敏度及内标的使用等技术,使其在定量蛋白质组学的研究中效果明显优于传统双向电泳。 DIGE使用的荧光染料有Cy2, Cy3和Cy5,它们能与蛋白质的赖氨酸侧链氨基反应而使蛋白质被标记,被标记蛋白质的等电点和分子量几乎不受影响,等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳,不同凝胶之间可以通过cy2内标匹配,消除凝胶之间的差异,蛋白质表达量的变化则通过cy3和cy5不同荧光的强度来体现。 2022/5/23 * 2022/5/23 * 5.5.3 蛋白质质谱分析技术 蛋白质组学中有意义的突破是用质谱鉴定电泳分离后的蛋白质。 基质辅助的激光解析电离-飞