废水生物处理新发展.pptVIP

核酸杂交技术研究环境微生物具有以下优点： （1）核酸可以直接从样品中提取，不必对微生物进行培养； （2）不管基因表达与否，都可以检测到特定的基因或核酸序列，从而能准确地跟踪、监测特定的微生物种群； （3）利用同一样品可以同时检测到众多不同的微生物类群； （4）可以直接检测到特定的核酸序列。 2001-12- 8 第29页，共64页，编辑于2022年，星期三 2001-12- 8 第30页，共64页，编辑于2022年，星期三 核酸杂交技术应用于环境微生物研究的一个重要局限就是它要比传统的方法复杂得多。 （1）从各种环境样品中提取核酸本身就包含众多繁冗的抽提和纯化操作，因此也是最复杂的步骤之一； （2）从富含能干扰核酸检测的污染物的样品（如土壤）中回收核酸，仍有待用一些特殊的技巧对现行的有关方法加以改善； （3）对任何一个自然微生物群落的研究常常需要对其多个平行样品进行分析和统计； （4）从水样等样品中检测以很低丰度存在的、或在整个微生物群落中仅占很小比例的微生物类群，核酸杂交技术的灵敏度尚需大幅度提高。 2001-12- 8 第31页，共64页，编辑于2022年，星期三 核酸杂交技术的一个缺点是只有对已被分离并已测序的微生物才能够放心使用。 微生物生态学家估计，到目前为止，在自然界中只有少数微生物能够被分离、培养。此外，被分离的微生物也可能并不能很好地代表自然环境中最重要的微生物。 无论微生物是否已被分离或已完成测序，具有能提供微生物群落多样性指纹信息的分子技术是非常有用的。 2001-12- 8 第32页，共64页，编辑于2022年，星期三 2001-12- 8 变性梯度凝胶电泳法（DGGE）是一种使用日益广泛的方法。在DGGE方法中，DNA在含聚丙烯酰胺凝胶电泳池的一端。电泳池两端的电极形成一个电场，带负电的DNA向正极运动。DNA分子的移动速率取决于其分子大小与带电量之间的比值，因此，不同的DNA分子运动到两个电极之间的不同位置上停下，从而形成具有指纹作用的DNA带。将DNA带从凝胶中分离出来，可以进行进一步的扩增及测序。 变性梯度凝胶电泳法（DGGE） 第33页，共64页，编辑于2022年，星期三 2001-12- 8 第34页，共64页，编辑于2022年，星期三 限制性片段长度多态性（RFLP）分析是另一种指纹分析方法。该法利用限制性内切核酸酶将被扩增的DNA切成片段，限制性酶对DNA的剪切能避开靶基因区。靶基因周围的侧翼区中具有不同数目的酶切位点。因此，限制性酶切后得到的DNA片段的大小不同，能够通过电泳分离。  2001-12- 8 限制性片段长度多态性（RFLP） 第35页，共64页，编辑于2022年，星期三 报告基因法为评价已表达的表型潜力提供了另一条途径。在报告基因法中，利用重组技术将报告基因插入DNA分子上的目标区域。当DNA序列被转录时，报告基因也同时被转录。来自报告基因的mRNA被翻译成能催化某些易于检测的反应的酶。发光是最常见的报告基因效应，其中绿色荧光蛋白（GFP）最为常用。 只有当完整序列被转录时才能观察到报告基因效应，因此，报告基因的表达意味着目标基因的表达。报告基因法可以对已表达的表型进行实时测定，其应用前景十分可观。 2001-12- 8 报告基因法 第36页，共64页，编辑于2022年，星期三 绿色荧光蛋白作为新一代的基因转移报告物 或定位标记物，在环境微生物研究中越来越受 到关注，GFP的优点： （1）不需加任何底物，经激发后即可产生荧光，且荧光性质稳定； （2）相对分子质量小，对细胞无毒性； （3）检测方便，可对活细胞进行实时定位观察； （4）已有多种GFP突变蛋白，荧光特性得到明显改善。 2001-12- 8 第37页，共64页，编辑于2022年，星期三 2001-12- 8 第38页，共64页，编辑于2022年，星期三 2001-12- 8 第39页，共64页，编辑于2022年，星期三 活性污泥中微生物多样性研究 丝状细菌的研究 脱氮微生物的研究 除磷微生物的研究 2001-12- 8 分子方法的应用 第40页，共64页，编辑于2022年，星期三 自1995年以来，基于16S rRNA基因库分析，人们对活性污泥和生物膜处理系统中微生物多样性进行了较广泛的研究。 大量的16S rRNA基因序列研究表明，这些处理系统中最常出现的微生物主要有?-、?-和? -Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria。这些发现与利用荧光原位杂交（FISH）研究活性污泥系统得出的结果一致。利用16S rRNA数据库还可以预测在所分析的系统中存在的细菌种属。 2001-12- 8