转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因的克隆及表达.pptxVIP

会计学 1 转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因的克隆及表达 操作目的： 采用RT-PCR技术，从黑曲霉的菌丝体RNA中扩散出葡萄糖淀粉酶GAT的结构基因，将其转接到pPIC9载体中，转入巴斯德毕赤酵母GS115中，获得重组酵母，使重组酵母中的葡萄糖淀粉酶活增高。 第1页/共9页 基因载体：pPIC9 操作方法： 1.引物设计，根据已知的黑曲霉葡萄糖淀粉酶一基因序列和表达载体，pPIC9的克隆位点，利用DNAsis设计一对扩增葡萄糖淀粉酶一基因的引物，上游引物为5 ’ -TACGTAGCGACCTTGGATTCATGGTT - - 3’,带有SnaB一位点；下游引物为5 ’ -GCGGCCGCACTATAGCGAAATGGATTGAG - 3’,带有Not一位点。 第2页/共9页 RT-PCR扩增： 首先，黑曲霉保藏菌种经查氏斜面培养基活化后，接种于100ml灭菌的黑曲霉液体发酵培养基中，加少量玻璃珠，200r/min、30℃，培养66~70h,以其为实验材料,利用总RNA提取试剂合提取黑霉的总RNA。再用RNA为模板，以下游引物进行反转录，获得cDNA第一条链。65℃热变性5min，冰浴，然后加入反转录酶，置于PCR仪中，30℃10min，42℃1h，94℃2min。 第3页/共9页 再以反转录产物为底物，PCR扩增目的基 因，反应条件为94℃3min热变性；94℃30s，5