Western-Blotting实验报告（附答案解析）.docxVIP

Western Blotting 本次试验的目的是使同学们掌握 Western Blotting 法鉴定目标蛋白的原理和 熟悉 Western Blotting 的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。 Western Blotting 的 blotting 译为印迹法，是指将样品转移到固相载体 上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975 年,Southern 建立 了将 DNA 转移到硝酸纤维素膜( NC 膜)上，并利用 DNA－RNA 杂交检测特定 的 DNA 片段的方法，称为 Southern 印迹法。而后人们用类似的方法，对 RNA 和蛋白质进行印迹分析，对 RNA 的印迹分析称为 Northern 印迹法，对单向电 泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western 印迹法，对双向电泳后蛋白质分子 的印迹分析称为 Eastern 印迹法。 Western 既可以定性,又可以半定量,是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用 的方法。它通常分为两种方法： Western Western Blotting 方法一： 直接法 方法二： 间接法 1 。 免特异性不受标记影 响 2 。 信号放大灵敏度高 (多个二抗结合位点) 3 。 多种标记的二抗可供 选择 1.快速(一种抗体) 2.没有二抗交叉反应引起 的非特异性条带 优点: 4 4 。 可 选 择 不 同 的 Marker 1. 交叉反应引起的非特 异性条带 2 。 额外的二抗孵育以及 条件优化 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3 。抗体标记费时昂贵 ,使 用不方便 缺点： 同时 Western 又具有多种识别蛋白质的显色方法,主要有以下几种：i 。放 射自显影 ii. 底物化学发光 ECL iii. 底物荧光 ECF iv. 底物 DAB 呈色 现常 用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色。 一、 实验原理 Western Blotting (蛋白质免疫印迹法)是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋力 的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜 )上，固相载体以非共价 键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相 载体上的蛋白质为抗原,与之对应的第一抗体发生免疫结合反应,一抗再与酶或同 位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色活放射自显影以检查电泳 分离的提议目的蛋白成分 .蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫 测定特异性高、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量 检测。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr) 、N,N— 甲叉双丙烯酰胺(Bis)和 催化剂(AP) 、加速剂(TEMED 聚合成的三维网孔结构(凝胶)。据有无浓缩效应 可将电泳分为两类: i. 连续系统：缓冲液 pH 值、凝胶浓度相同，带电粒子靠电荷及分子筛效 应区分. ii. 不连续系统：缓冲离子成分、 pH 值、凝胶浓度不同，带电粒子在电场 中由电效应、 分子筛效应、浓缩效应区分。 SDS的原理是：依靠 SDS 带有大量负电荷来掩盖蛋白质表面的净 电荷：同时由于在电泳溶液中加入了 SDS 和巯基乙醇，因此它还可以改变蛋白 质构象： 在实验中要注意:印迹法需要较好的蛋白质凝胶电泳技术，是蛋白质样品达 到良好的分离效果，而且要注意胶的质量，是蛋白质容易转移带固相支持物上， 另外蛋白质在电泳过程中分离得到的条带被保留在膜上，在随后的宝物阶段不丢 失和扩散。免疫印迹分析之需要很小体积的时间,较短的时间过长，操作容易,适 用于理论和应用上的研究。 本实验采用人血清为材料，人类 Ig 根据其重链稳定区的分子结构和抗原特 异性的不同，分为五类： IgG 、IgA 、IgM 、IgD 、IgE 。其中 IgG 占血清免疫球 蛋白总量的 75％~80% 。人的 IgG 由两条重链和两条轻链组成，它们之间以二 硫键相连。在加 SDS 的电泳条件下，分子中的二硫键被还原成游离的巯基,四条 链分开,重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带。对此样品进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS)后，用电转移法将蛋白质转印到硝酸 纤维素薄膜上，用兔抗人 IgG 为第一抗体，用辣根过氧化酶标记的羊抗兔 IgG 为第二抗体，在过氧化物酶第五存在的情况下，检测人的 IgG. 二、 试剂，器材和实验材料 【试剂】 1. 30％丙烯酰胺贮备液： 29.2g 丙烯酰胺， 0 。8g 甲叉双丙烯酰胺，加重蒸 水至 100ml. 2. 浓缩胶缓冲液： 0 。5mol/L Tris— HCl,pH6 。8. 3. 分离胶缓冲液：