免疫组织化学课件.pptx

1 免疫组织化学操作方法 免疫组织化学操作方法 2 免疫组织化学操作方法 免疫组织化学操作方法 3 免疫组化染色操作注意事项 Ab稀释度 （如系购买的药盒有工作液和原液 工作液： 无须稀释 原液： 应参照其提供的工作液浓度进行预试验。如：工作液浓度为1∶1000， 可选1∶500，1∶1000，1∶1500试验；若: 1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍浅，可选1∶750进行试验。 免疫组织化学操作方法 4 Ab滴片技术 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。［注意］ 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。  免疫组化染色操作注意事项 免疫组织化学操作方法 5 PBS洗涤技术 保证离子浓度和PH值。 减少非特异反应。 Ab孵育技术 必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。 温度与时间 4℃：过夜，＞16h，37℃：1 h，或者参考说明书。 免疫组化染色操作注意事项 免疫组织化学操作方法 6 光镜控制显色 室内操作：注意温度与时间的关系，室温最宜5分钟。 染色稍浅亦可终止显色，脱水，封片后颜色可加深。 免疫组化染色操作注意事项 免疫组织化学操作方法 7 对照组和染色结果的评价 免疫组化染色实验组与对照组结果分析表 序号 阳性对照 阴性对照 替代对照 实验组 结论 1 - - - - 操作失误 2 + + + + 非特异性反应 3 + + - ± 阴性对照含有定位Ag 4 - - - + 阴性对照不含定位Ag 5 + - + + 受检查组织非特异性染色 6 + - - - 受检组织中不含定位Ag 7 + - - + 受检组织中含定位Ag 免疫组织化学操作方法 8 对照组和染色结果的评价 除上述对照结果分析之外，还必须从以下几个方面综合评价： 1．阳性染色特点① Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性～细胞与组织无区别）② 染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色 弥散性均匀） 免疫组织化学操作方法 9 对照组和染色结果的评价 除上述对照结果分析之外，还必须从以下几个方面综合评价： 2．组织切片制作过程的影响① 固定不良—非特异性染色，显示不均。② 边缘干燥—非特异性染色（常见），加抗体时勿干片。 3．人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。 免疫组织化学操作方法 10 所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内。全部（－）原因可能： ① 染色未完全严格按照操作步骤进行； ② 漏加一种抗体，或抗体失效 ③ 底物中所加H2O2 量少或失效； ④ 复染或脱水剂使用不当。 免疫组织化学操作方法 染色失败的几种原因 11 染色失败的几种原因 所有切片均呈阳性反应，原因可能是： ① 切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。 ② 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，洗涤不彻底。 ③ 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。 ④ 抗体温育的时间过长。 ⑤ H2O2 浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太厚。 免疫组织化学操作方法 12 染色失败的几种原因 所有切片背景过深，原因可能是 ①切片或涂片过厚； ②漂洗不够； ③底物呈色反应过久； ④蛋白质封闭不够； ⑤使用一抗体稀释不够。 免疫组织化学操作方法 13