科大高分子四聚合物在生物高分子分离中应用.pptxVIP

会计学 1 科大高分子四聚合物在生物高分子分离中应用 第1页/共22页 第2页/共22页 蛋白质在低于等电点时会带上正电荷，在高于等电点时带负电荷． 若缓冲溶液的pH值低于蛋白质等电点，蛋白质则吸附H＋ 而带正电荷，由于 静电相互作用，蛋白质与管壁发生吸附。 第3页/共22页 （a）碱性蛋白质（pI＝8）所带电荷量随pH的变化曲线； （b）在pH＝4时，碱性蛋白质（pI＝8）与毛细管壁发生吸附 第4页/共22页 １. 极端pH值法 pH高于蛋白质的pI时，毛细管内壁对蛋白质产生静电排斥抑制吸附，但是，蛋白质存在的自然状态为pH4－10，高pH如11.0时，容易使蛋白质变性或者水解。 pH小于1.5（熔融硅或石英的等电点）时，蛋白质的质子化导致其质荷比差别较小，分辨率难以提高。 对等电点相近的蛋白质不易实现分离。 一般认为，使蛋白质混合物分离的首选pH值应和蛋白质混合物的pKa值基本一致。 McManigill D. Anal Chem,1986，58：166～170. 第5页/共22页 2. 添加小分子添加剂 表面活性剂：季铵盐和氟化的阳离子表面活性剂。 中性盐：如磷酸盐，硫酸钾等。 胺类：三乙醇胺、三乙胺、N-乙基二乙醇胺，N,　N, N’,　N’-四甲基-1,　3 -丁二胺（TMBD）等。 有机溶剂：醇类、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜等，其中最常用的是甲醇和乙腈。 选用极端pH值或添加小分子添加剂的方法虽然能从一定程度上降低蛋白质吸附，但是容易导致蛋白质聚集和变性。目前最常用的方法是用聚合物对毛细管内壁进行改性处理。 何金兰等.高效毛细管电泳. 北京：科学出版社，1996, 72～75. Verzola B, Gelfi C, Righetti P G. J Chromatogr A，2000，868：85～99. Corradini D, Cannarsa G, Fabbri E, et al. J Chromatogr A，1995，709：127～134. Corradini D, Cannarsa G. Electrophoresis，1995，16：630～635. 第6页/共22页 ３.聚合物涂覆毛细管内壁抑制　　蛋白质吸附 (1) 化学键合的毛细管涂层 化学键合的交联的PVA涂层对4种碱性蛋白质实现第2次和第902次分离的电泳图谱 样品浓度：50ug/mL的（1）细胞色素C，（2）溶解酵素，（3）胰蛋白酶原，（4）胰凝乳蛋白酶原。分离条件：毛细管，内径50μm，总长48.5cm（有效长度40cm）；注入，3 kV, 5 s；缓冲液，40mM磷酸钠；分离，309 V/cm 第7页/共22页 (2)物理吸附的毛细管涂层 目前使用的聚合物： 　　中性的聚合物－已经广泛用于DNA和其它一些生物大分子的分析，但是由于蛋白质的吸附作用，使得对蛋白质的分析仍有一定难度。 　　亲水性的聚合物－如甲基纤维素，聚糖等不能很好的吸附在管壁上，稳定性差。 　　带疏水基团的聚合物－聚乙烯基吡咯烷酮，聚N,N-二甲基丙烯酰胺可以形成稳定的涂层，但是由于疏水基团与蛋白质之间的相互作用使得分离效率下降。 Madabhushi R S. Electrophoresis，1998，19：224～230. Verzola B, Gelfi C, Righetti P G. J Chromatogr A，2000，874：293～303. 第8页/共22页 羟乙基纤维素的改性 Formation of the cat-HEC Schematic diagram of adsorption of cat-HEC onto silica surface. (1) Cat-HEC No. HEC (g) Glycidyltrimethylamminium chloride (g) Viscosity (mp.s) Nitrogen content (%) Cat-HEC-1 10.0 2.5 380 0.8 Cat-HEC-2 10.0 5.0 375 1.3 Cat-HEC-3 10.0 7.5 370 1.7 Preparation and properties of Cat-HEC 第9页/共22页 Electroosmotic flow as a function of pH. Comparison between a bare fused-silica capillary, HEC and cat-HEC coated capillary Electropherograms of a mixture of standard proteins. Separations wer